释放膜微粒：间充质干细胞治疗的新机制

李志勇 郭子宽 综述 郭志坤 审校

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，具有易于取材和体外扩增能力强等特点。此外，MSC免疫原性低，且具有很强的免疫调节作用。因此，作为细胞治疗和组织工程的重要种子细胞，MSC已经进入临床试验阶段。研究表明，MSC植入体内后，可分化为成骨和软骨细胞，通过细胞替代的方式，进行骨和软骨组织的修复，以治疗骨关节炎、骨折后骨不连、半月板损失等疾病。此外，MSC也可参与包括血管、心肌、脊髓、脑等其它组织的修复，用于肢体动脉硬化、心肌梗死、脊髓损伤等疾病的治疗。鉴于MSC明确的骨、软骨和脂肪分化能力，且植入这些组织后外源MSC在短时间内死亡，人们有理由相信，MSC修复上述组织损伤的主要机制在于细胞的旁分泌作用。即MSC的分化和/或分泌作用，是治疗不同疾病的机制所在。

例如，MSC能分泌多种细胞因子、趋化因子及生长因子，被认为是MSC参与心肌组织修复的主要因素。然而，利用心肌缺血再灌注模型研究发现，MSC条件培养基能明显减少心肌梗死的面积，而当用滤膜去除条件培养基中的分子量大于1000 KDa的物质后，其对心肌的保护作用消失[1]。将分子量1000 KDa以上的物质进行静脉输注，又可恢复与先前几乎相当的心肌保护作用。结果表明，心肌保护作用似乎不是直接源于分子量通常为十几个KDa的因子，而具有磷脂包裹特性的、可与目的细胞快速结合的某种细胞亚结构，极有可能是MSC发挥生物学效应的主要成分。这种亚结构就是膜微粒（Micro-particles，MP）[1]。

近几年的研究发现，外源MSC进入体内组织后，在应激或低氧低营养的条件下，可以通过出芽的形式产生膜微粒；后者作为一种细胞死亡或活化信号，可能承载着移植细胞修复其周围组织的主要责任。

1 膜微粒的产生机制

虽然膜微粒表面抗原及胞质成分等与其来源细胞有很多相似之处，但膜微粒绝不仅仅是其来源细胞的“袖珍版”。膜微粒的释放可能是多因素叠加的结果。在细胞激活途径中，激活诱导物通过使细胞内的Ca2+聚集，导致转位酶等多种酶效能降低或被抑制，进而使磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙胺醇不能被转运到细胞内膜，最终导致细胞膜的磷脂双层结构发生不对称重排，磷脂酰丝氨酸暴露于细胞膜外侧[2]。Ca2+浓度增加时，导致细胞骨架蛋白断裂、重构，最终质膜出芽并脱落，微粒形成。在凋亡途径中，膜微粒的形成依赖ROCKⅠ的激活，ROCKⅠ能促进肌球蛋白轻链的磷酸化并和肌动蛋白相互结合，引起细胞骨架的重排进而形成膜微粒[3]。

2 膜微粒的结构特点

几乎所有的真核细胞，包括干细胞及前体细胞在内[4－5]，在接受刺激或凋亡过程中，均会通过质膜出芽的形式产生膜微粒。在质膜出芽过程中，包裹一定的细胞质，其中富含多种细胞因子、趋化因子、酶类、生长因子及信号蛋白[6]，某些细胞来源的膜微粒还含有功能性RNA及微小RNA[7]。这些微粒成分绝不是随机包裹进来的，而是为实现某种生物学功能，通过某些未知机制组装而成的。膜微粒作为一群细胞亚结构，能稳定存在于多种体液内[8]，体外反复超速离心或冻融均不影响其形态大小，但4℃或37℃保存可能导致膜微粒结构降解[9]。膜微粒呈球形结构，直径约为40～1000 nm，约105 g的离心力作用1 h，完全可以使其沉积于管底。膜微粒的质膜富含脂质载体、胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺和暴露的磷脂酰丝氨酸[10]。虽然不同的细胞时相或微环境能够影响膜微粒的内容物，但MSC来源的膜微粒拥有一些共同的表面蛋白，如：CD81、CD9、CD63 及 Alix等透膜蛋白[11]。 此外，MSC-MP 还携带其母体细胞特有的黏附分子，如CD29、CD44、CD73等。间充质干细胞在凋亡过程中，不但释放凋亡小体，而且可以释放膜微粒等其他微囊物质。

值得注意的是，直至目前，人们尚未对膜微粒进行明确的定义。一般认为，膜微粒特点如下：①直径在40～1000 nm，具有球形结构；②具有细胞骨架、磷脂双层结构；③缺乏细胞核或缺乏合成蛋白的能力；④可以来源于不同的细胞，并表达来源细胞的表面特异抗原；⑤发生在细胞凋亡早期，高表达磷脂酰丝氨酸[12]。这些特点与内涵体和凋亡小体有很大的区别。内涵体在细胞受激活时产生且不具有Annexin V结合能力。凋亡小体的直径可高达4000 nm，发生在凋亡晚期，具有Annexin V高亲和力。

3 膜微粒发挥生物学效应的途径

膜微粒表面有为数众多的膜结合蛋白、膜锚定受体、黏附分子、细胞表面特异抗原等，通过这些细胞表面分子，膜微粒可以在不同的细胞之间进行信息的传递。在形成膜微粒的过程中，大量的细胞内含物（细胞因子、趋化因子、生长因子、信号通道蛋白等）及RNA和微小RNA[7]包被于膜微粒中。大量研究显示，膜微粒可能主要通过两种途径发挥作用：第一，由于膜微粒中包含了大量的内容物（细胞因子、RNA及其表面活性脂质结构），因此膜微粒通过与目的细胞融合或直接释放其内容物，从而激活细胞，改变细胞表型，使受体细胞功能发生改变[13]；第二，膜微粒可以通过其表面的分子与其相应的抗体结合从而激活目标细胞。目标细胞一旦被激活，即启动相应的信号传导通路，产生应答。同时，膜微粒不只停留存在于起源细胞的周围，也可以随血液循环迁徙至全身各处。因此，膜微粒以上两种信号传递的途径不止可以发生在其周围细胞，即使远离起源细胞的组织也可以受惠于其有益的修复作用。最近研究结果显示，MSC-MP还可以趋化其他具有修复效应的细胞及细胞因子迁徙至损伤部位，促进细胞增殖分化，从而达到损伤修复的目的[14]。MSC来源的膜微粒可能通过以上途径，将生物活性蛋白、生物脂类及功能核酸分子转入受损目的细胞，使受损细胞得到恢复或使周围的固有干细胞增殖，分化为功能细胞，从而恢复器官功能。

4 膜微粒临床应用

研究证实，来源于MSC的膜微粒具有组织再生修复能力[15]和高效的免疫调节及细胞定向分化等功能[16]，多次直接心内膜注射MSC是相当安全的[17]。但是，Furlani等[18]发现静脉注射MSC后，远端末梢毛细血管出现阻塞现象及部分出现心律失常。动物实验显示，体内直接植入MSC，发现MSC向成骨和成软骨细胞分化，且在不同组织中出现骨化和钙化现象[19]。膜微粒的直径足够小，不仅可以快速通过毛细血管，到达病损部位，而且可以通过膜上受体与受损细胞结合，进而修复损伤组织；同时，也避免了直接注射MSC的不利生物学效应，减少了临床风险。膜微粒内含物只有顺利进入目的细胞内，才能发挥其修复作用[7]。这些因子可通过具有磷脂膜包被的膜微粒进入细胞，方式可能包括与目的细胞的融合、配体结合、胞吞及胞饮等多种途径[20]，从而将有效的生物学成分转运至特定的靶分子。这种活性物质转运方式，避免了体内酶类及化学物质的降解，保证了细胞因子及核酸的稳定性、完整性及生物学能力。只要膜微粒的类脂膜不被破坏，膜微粒中的蛋白及RNA绝不会被胰蛋白酶及RNA酶降解[21]。膜微粒的膜表面存在为数众多的膜蛋白（像转铁蛋白受体、肿瘤坏死因子受体及结合素类等），与目的细胞配体及胞外基质有高度的亲和性。故而，在这些膜蛋白的作用下，膜微粒可以快速到达特异组织及微环境，同时，可能具有促使膜微粒内容物快速进入目的细胞的能力，加速治疗蛋白或RNA进入受损细胞。总之，膜微粒不仅具有MSC治疗的生物学特性，而且消除了MSC实施的弊端，有可能成为再生医学研究中新的关注点。

5 膜微粒应用的前景及存在的问题

膜微粒具有保存稳定、方便，与目的细胞多途径靶向性结合等优点，使其能够特异性地作用于受损组织[22]。此外，MP的脂质膜结构能够阻止各种酶类对其生物分子的降解，从而达到高效修复的目的。然而，膜微粒的提取和制备等规范化问题尚未解决，膜微粒与凋亡小体的分离、提纯等问题均需要科学的解决办法。来源细胞状态及微环境等均可影响膜微粒的生物学性质及成分。Hood等[23]发现膜微粒可能通过促进血管再生，从而具有促进体内肿瘤生长的风险。这些安全隐患应得到重视。

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