EB病毒BARF1基因真核表达载体的构建

刘智群 王梅梅 侯灵彤 张 放 熊亚南 刘 敏 李淑英*

(河北联合大学冀唐学院，①基础医学院，②附属医院 河北唐山 063000;③唐山市中医院)

EB病毒BARF1基因真核表达载体的构建

刘智群 王梅梅①侯灵彤②张 放②熊亚南①刘 敏③李淑英①*

(河北联合大学冀唐学院，①基础医学院，②附属医院 河北唐山 063000;③唐山市中医院)

①目的 构建携带EB病毒(Epstein－Barr virus，EBV)编码BARF1基因的真核表达载体。②方法 根据GenBan提供的BARF1基因的cDNA序列，设计特异性引物，并在两端添加酶切位点;常规培养B95－8细胞，提取细胞RNA，通过RT－PCR扩增BARF1基因，将其克隆到pUM－T载体，转化E.coli DH5α，经氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切与测序鉴定，证实BARF1基因已克隆到pUM－T载体。凝胶回收双酶切产物BARF1片段，再将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)－his，转化E.coli DH5α，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切分析，确认插入方向。③结果 以B95－8细胞提取RNA进行RT－PCR扩增的cDNA为模板扩增BARF1，得到与预期片段大小相符的666bp的片段;对所提质粒进行鉴定后，证实目的基因BARF1片段已插入pUM－T载体，经双酶切和测序分析，确认BARF1基因已正确连接到pcDNA3.1(+)－his真核表达载体。④结论 成功地构建真核表达载体。pcDNA3.1(+)/BARF1 － his。

EB病毒 BARF1基因 真核表达载体

BARF1是 EB病毒(EPstein－Barr virus，EBV)编码的BamH I A区域的早期裂解基因，是近年来确认的EBV新的致癌基因，可促进上皮细胞永生化和转化等功能［1，2］。为探讨BARF1基因对人胃上皮细胞的影响，我们构建了携带BARF1基因的真核表达载体。

1 材料与方法

1.1 材料 B95－8细胞、真核表达载体 pcDNA3.1(+)－his

及感受态Ecoli DH5α本室保存。pUM－T载体、RNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、RT－PCR试剂盒、RPMI1640细胞培养液、小牛血清及2xPower Taq PCR Master Mix均购于北京百泰克生物公司;限制性内切酶EcoRI及XbaI购于TakaRa生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成。根据GenBank提供的BARF1基因序列，设计扩增目的基因BARF1的特异性引物，并在引物两端添加酶切位点，引物序列见表1。

表1 本研究中使用的扩增引物

1.2.2 RT－PCR。常规培养B95－8细胞于RPMI1640完全培养液(含10%灭活的小牛血清，100U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)中。提取细胞RNA(按试剂盒说明书操作)。RT－PCR扩增cDNA。

1.2.3 目的基因BARF1的扩增。PCR反应体系(20uL):2×Power Taq PCR Master Mix 10mmol/L，primer 10 pmol/L(使用引物BARF1#1与2)，加入2μL的cDNA作为模板，加双蒸水至20μL。反应条件:95℃预变性5min，循环参数95℃/1min，55℃/1min，72℃ /1min，5 个循环;95℃ /20s，55℃ /30s，72℃ /30s，35 个循环;72℃延伸5min;4℃保存。PCR产物在含0.01%Gold View的1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测。凝胶成像仪照相。

1.2.4 BARF1基因的T－A克隆与鉴定。目的基因BARF1扩增产物与pUM－T载体克隆反应按试剂盒说明书操作。碱裂解法提取质粒;对所提质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。PCR鉴定方法同1.2.3，引物改为BARF1#3与4。酶切鉴定反应体系:T－A克隆质粒 5μL，10× Buffer(TangTM)1μL，EcoRI和 XbaI内切酶各1μL，无菌去离子水2μL。置37℃温箱2小时后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。委托北京百泰克生物计划有限公司测序。

1.2.5 BARF1真核表达载体的构建与鉴定。将上述T－A克隆的双酶切产物BARF1进行胶回收(按试剂盒说明书操作)。用EcoRI和XbaI进行双酶切真核载体pcDNA3.1(+)－his，反应体系:pcDNA3.1(+)－his质粒 5μL，10×Buffer(TangTM)1μL，EcoRI和 XbaI内切酶各1μL，无菌去离子水 2μL。置 37℃温箱2小时后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。并进行胶回收。将回收BARF1片段与pcDNA3.1(+)－his片段见表2。

连接产物转化感受态E.coli DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板中筛选，用含有氨苄青霉素的LB液体培养基培养，碱裂解法提取质粒;对所提质粒进行酶切鉴定。

表2 真核载体pcDNA3.1(+)－his与BARF1连接体系(20μL)

2 结果

2.1 细胞RNA提取 将所提RNA进行琼脂糖凝胶电泳得到28S、18S和5S共3条带见图1;从图1可以看出，我们所提RNA较为完整，无明显降解现象。

图1 B95－8细胞中提取的RNA:图中B95－8是B95－8细胞提取的RNA。

图2 目的基因BARF1基因的扩增:图中M1:100bp的maker，B95－8是目的基因BARF1扩增产物

图3 对质粒1和质粒2进行BARF1基因扩增鉴定:图中M:23.1kb的λDNA－maker;M1:100bp的maker，质粒1与质粒2分别是所提的两个质粒BARF1基因的鉴定。

图4 对质粒1和质粒2双酶切鉴定:图中M:23.1kb的λDNA－maker;M1:100bp的maker，质粒1与质粒2分别是所提的两个质粒的双酶切鉴定。

图5 真核质粒双酶切鉴定:图中M为λDNA－maker;M1为100bp－maker;1、2、3和4 分别是质粒1、2、3和4的双酶切鉴定。

2.2 目的基因的扩增 以RT－PCR所得cDNA为模板扩增目的基因，经琼脂糖凝胶电泳，得到大小约为666bp的片段(图2)，与我们预期结果一致。

2.3 BARF1基因的T－A克隆与鉴定 为了验证目的基因是否已经被成功连接到pUM－T原核载体上，我们对提取的质粒进行了BARF1基因的扩增鉴定，经琼脂糖凝胶电泳得到大小为524bp的片段(图3)，与预期片段大小相一致，说明BARF1基因已克隆到pUM－T载体。双酶切鉴定:为了进一步证实BARF1基因已克隆到pUM－T载体，我们对提取的质粒进行双酶切，并对酶切产物进行电泳，琼脂糖凝胶电泳结果，得到3个不同的片段(图4)，其大小分别为3.4kb(可能为未被切的质粒)、2.7kb(与pUM－T载体大小相一致)及666bp(与插入的目的基因大小一致)。

2.4 BARF1真核表达载体的构建与鉴定 BARF1与真核表达载体 pcDNA3.1(+)－his连接、转化感受态 E.coli DH5α，经氨苄青霉素抗性筛选后，对所提质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳得到5.4kb及666bp两个片段(图5)。测序结果证实我们构建的携带BARF1基因的真核表达载体完全正确，将其命名为pcDNA3.1(+)/BARF1 － his。

3 讨论

EB病毒(Epstein－Barr virus，EBV)是一种致瘤病毒，该病毒DNA以线性双链的构型存在，基因组大小为172Kb。BARF1是近年来确认的EBV新的致癌基因，其致癌作用日益受到关注。李友琼等［3］将BARF1基因转染胃癌细胞系SGC7910后，能够全面增强胃癌细胞的肿瘤原性。Sheng等［4］应用删除突变方法研究了BARF1基因中不同区域对细胞的转化作用，发现删除BARF1的N端序列便失去了对细胞的转化作用，此段序列编码的氨基酸可以激活抗凋亡基因bcl－2的表达，提示对细胞的转化是必需的。

由于目前BARF1基因在胃癌发生发展中的确切作用尚不清楚，并且在体内研究某一单个基因较为困难，我们将通过构建携带BARF1基因的真核表达载体 pcDNA3.1(+)/BARF1－his，建立稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞系，从而建立BARF1基因致瘤的体外模型，研究BARF1基因在胃癌发生发展中确切作用。

不同的载体，其转染效率和表达量均不同;本研究选用真核表达载体 pcDNA3.1(+)－his，因该载体含有巨细胞病毒(CMV)启动子及SV40复制起点，启动子启动效率高，宿主细胞谱广泛，易于在哺乳动物细胞中表达。通过构建pcDNA3.1(+)/BARF1－his载体可实现对BARF1基因的分析。

本研究中利用T载体进行TA克隆后，通过EcoRI和XbaI双酶切，得到带有双酶切位点的目的基因片段。为准确地表达BARF1基因，我们将TA克隆的目的基因进行了测序分析，确认所得目的基因与Genbank中的标准株的基因序列同源性为99.9%，并与真核表达载体连接。在确认序列正确后，还要保证插入片段方向的正确，这样才可保证翻译的蛋白质具有相应的功能。对我们所构建的真核表达载体，通过酶切对插入的方向进行确认。由于内切酶切割不同的酶切位点可以得到不同大小的片段。我们通过EcoRI和XbaI双酶切所构建的真核表达载体，得到与载体pcDNA3.1(+)－his和目的基因大小相当，约为5.4kb和666bp两个片段，说明目的基因插入的方向正确。从而为建立稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞系，研究BARF1的功能奠定了良好的基础。

［1］ Seto E，Yang L，Middeldorp J，et al.Epstein Barr virus(EBV)encoded BARF1 gene is expressed in nasopharyngeal carcinoma and EBV－associated gastric carcinoma tissues in the absence of lytic gene expression［J］.J Med Virol，2005，76(1):82

［2］ Fiorini S，Ooka T.Secretion of Epstein Barr virus encoded BARF1 oncoprotein from latently infected B cells［J］.Virol J，2008，5(70):1186

［3］ 李友琼，张雪怡，曾 健，等.EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞株SGC7910生物学行为的影响［J］.江苏大学学报(医学版)，2009，19(3):214

［4］ Sheng W，Decaussin G，Sumner S，et al.N － terminal domain of BARF1 gene encoded by Epstein－Barr virus is essential for malignant transformation of rodent fibroblasts and activation of BCL － 2［J］.Oncogene，2001，20(10):1176(2011－11－17 收稿)(岳静玲 编辑)

Construction eukaryotic vector for BARF1 gene of epstein － barr virus

LIU Zhiqun，WANG Meimei，HOU Lingtong，et al(Jitang College of Hebei United University，Tangshan 063000，China)

Objective To construct eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)/BARF1－his with recombinant of BARF1 gene encoded by EBV and pcDNA3.1(+)－ his.Methods The specific primers were designed according to the BARF1 gene cDNA sequence in GenBank provided and restriction sites added at both ends;B95 －8 cells was cultured，the cell RNA was extracted，BARF1 gene was amplified by RT－PCR.The PCR products of BARF1 were cloned into pUM －T vector and transformed into E.coli DH5α.The positive clones were screened by ampicillin resistance，identified by restriction enzyme digestion of EcoRI and XbaI.Confirmation the BARF1 gene has been cloned into pUM－T vector.BARF1 fragments were recovered by Gel double－digestion product，and then inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)－ his，transformed into E.coli DH5α.The positive clones were selected by ampicillin resistance，and insertion direction was confirmed by double digestion and sequencing analysis.Results 666bp products of BARF1 were obtained with cDNA by RT－PCR of B95－8 cell RNA.BARF1 gene fragment was inserted into pUM －T vector by identification of double－digestion.BARF1 gene has been properly connected to the pcDNA3.1(+)－his eukaryotic expression vector through sequencing analysis.Conclusion The eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)/BARF1 －his was constructed successfully.

BARF1.Prokaryotic vector.Recombinant

R 735.2

A

2095－2694(2012)01－004－03

河北省科技厅课题(编号:Z2008316)。

刘智群(1982－)，女，本科，助教，主要研究方向:病毒相关的肿瘤。

*通讯作者。

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