高效液相色谱法测定黑木耳中还原型谷胱甘肽的含量

韩玲，黄成泽，张小勇

（延边大学分析测试中心，吉林 延吉133002）

高效液相色谱法测定黑木耳中还原型谷胱甘肽的含量

韩玲，黄成泽，张小勇＊

（延边大学分析测试中心，吉林 延吉133002）

优化溶剂提取、分离条件，并利用高效液相色谱法测定了野生和栽培黑木耳中的还原型谷胱甘肽（GSH）含量.结果表明：野生木耳和栽培木耳均含有较高的GSH，其中野生木耳的GSH含量（2.354 5 mg／g）高于栽培木耳（1.148 0 mg／g），这可能与其生长环境有关；木耳可作为一种重要的外源性GSH来源的食用菌.

食用菌；黑木耳；谷胱甘肽；液相色谱法；生物活性

0 引言

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是存在于动植物和微生物细胞内的一种生物活性三肽，由L－谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成.由于GSH具有抗氧化、抗衰老、抗癌等重要的生物活性功能，因此被广泛应用在医药、保健等领域［1－4］.随着人们对GSH的生物活性功能的进一步了解，筛选富含GSH的药食两用植物或菌属类作为外源性GSH补充剂来防病、治病受到人们的极大关注［5－6］.目前制备GSH的生产工艺是菌类生物合成法［7－8］，这意味着天然生长的菌类可能富含GSH和具备最佳GSH生物合成的化学环境.黑木耳（Auricularia auricula）是延边地区特色产品之一，食味鲜美、营养丰富，是具有很高实用价值的药食两用菌类.吴瑞宪［9］对黑木耳的营养成分进行了研究，发现黑木耳中富含蛋白质、碳水化合物和各种维生素类以及钙、磷、铁等人体必需的宏量和微量元素.目前，对黑木耳中的活性成分的研究大多集中在碳水化合物中的活性多糖类.研究［10－11］表明，黑木耳中的多糖不仅具有抗凝血、抗肿瘤、抗炎症等作用，还具有降低血脂、血糖、血液黏度、胆固醇以及抗糖尿病、抗衰老、抗辐射，促进核酸、蛋白质的生物合成和防治多种老年性疾病等功效.关于黑木耳中活性肽GSH的含量测定及其相关生物活性功能的研究未见报道.本文采用溶剂提取法和高效液相色谱法测定了黑木耳中GSH的含量，并发现黑木耳中富含GSH.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

仪器：Agilent1100－1946A液质联用仪（HP），液相色谱（配有在线二极管阵列DAD紫外检测器），超声波清洗器（天津奥特赛仪器有限公司As2120B），RE－52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），TDL－60B离心机（上海安亭科学仪器厂）.

试剂：谷胱甘肽（Sigma），样品处理过程中所用试剂（三氟乙酸、乙醇、丙酮、磺基水杨酸、三氯乙酸、甲酸、乙酸）均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水，色谱溶剂甲醇和三氟乙酸均采用色谱纯试剂，GSH的对照品是新鲜配制的溶液.精密称取4.000 mg GSH和GSSG标准品，置于20 m L容量瓶中，用稀盐酸（0.1 mol／L）溶解，摇匀后定容至刻度，分别得到0.20 mg／m L GSH和GSSG的对照品溶液.

1.2 实验材料和样品处理

黑木耳为野生和人工栽培的干品，采摘时间均不足1年.分别称取已干燥研磨成细粉的黑木耳干品0.30 g，加入25 mL 0.10 mol／L HCl，超声40 min，过滤.滤液加入2倍体积的甲醇，5 000 r／min离心8 min，除去蛋白后上清液移到旋转蒸发仪浓缩至1／3的体积，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液.

1.3 液相色谱仪器的测定条件

色谱柱为 Capcell Pak C18柱（5μm，2.0×150 mm），流动相为水（含0.1%三氟乙酸）－甲醇＝98∶2（体积比），流速为0.2 mL／min，柱温为5℃，紫外检测波长选为200 nm（实验发现该波长处GSH和GSSG具有较强的吸收），进样量为5μL.

1.4 色谱流动相的选择

实验中分别采用不同配比的甲醇－甲酸、甲醇－乙酸和甲醇－三氟乙酸作为流动相对供试品样品进行测定.发现在 MeOH－HCOOH、MeOHCH3COOH流动相体系中，GSH的保留值很小，易与供试品中的氨基酸等低保留组分的色谱峰重叠.当采用0.1%CF3COOH－MeOH＝98∶2（体积比）的流动相时，GSH的保留时间有效提高，并且减小了与供试品中低保留组分的重叠，分辨率增加.这可能是流动相中的三氟乙酸是较强的离子对试剂，由于在酸性环境下GSH带正电荷，它易与洗脱液中的三氟乙酸负离子生成电中性的离子对，使其易于在非极性柱上保留，进而提高了GSH的保留时间.

1.5 蛋白沉淀剂的选择

实验中用0.39 mol／L 5－磺基水杨酸、0.61 mol／L三氯乙酸等强酸和丙酮、乙醇、乙腈、甲醇等有机溶剂分别对植物样品的盐酸提取液进行除蛋白处理，结果发现溶液均变为混浊，这表明有蛋白质的析出.对处理液进行高速离心分离，上清液再用微孔滤膜过滤，滤液用液相色谱进行测定.结果发现无论用强酸，还是用有机溶剂进行除蛋白处理，在色谱测定区域都出现了较宽的响应谱带，对分析测定产生了影响，这可能是溶剂在200 nm处都有吸收的缘故.利用旋转蒸发仪（40℃水浴）把除蛋白处理的溶液在低温下蒸发，可全部去除其中的有机溶剂，消除其所引起的干扰.由于流动相中有甲醇，且其沸点低易挥发，因此本文最终选定甲醇为蛋白沉淀剂（甲醇2倍体积于样品提取液）.

2 结果和讨论

2.1 黑木耳供试品中GSH的定性分析

为了便于对供试品中的GSH色谱峰进行定性，首先在上述优化的色谱条件下取适量的GSH标准溶液（0.20 mg／mL），然后进行色谱测定，结果见图1.如图1所示，GSH的保留时间为5.4 min.

图1 GSH的色谱图

图2为在同样的条件下测定野生和栽培木耳提取液的色谱图，其中A和B分别为野生和栽培木耳样品的色谱图，C和D分别为野生和栽培样品中加入0.02 mg／m L GSH标样后的色谱图.图2表明，经除蛋白处理的野生和供试品溶液，在保留时间5.4 min附近都可以观察到GSH色谱峰.其中：野生木耳的色谱峰干扰较少，基本能够达到基线分离；栽培木耳共存组分的干扰较大，未达到基线分离.这说明栽培木耳和野生木耳的组成成分存在差异（可能是样品中的氨基酸或多元醇）.当黑木耳供试品中加入标准的GSH溶液时，GSH的色谱峰明显增大，说明该色谱峰可能为GSH的色谱峰.为了进一步定性色谱峰，利用液质联用仪测定了GSH的标准溶液的质谱图和野生黑木耳提取液中GSH的离子流图（图3）.

图3显示，GSH在电喷雾质谱图上具有灵敏的质谱响应，并且黑木耳提取液在保留时间5.7 min附近具有明显的GSH的离子流，这说明黑木耳中保留值5.7附近的色谱峰是GSH的色谱峰.

图2 色谱图

图3 GSH的质谱图和野生黑木耳提取液在m／z 306处的离子流图

2.2 GSH的色谱定量分析

图4为利用色谱外标法测定GSH的校正曲线.图4表明，色谱峰的面积与选定的GSH浓度范围内呈良好的线性关系，其线性回归方程为A＝0.627＋39 452.92C，相关系数R＝0.999 9.表1数据为外表法测定木耳中GSH的含量.数据表明，野生木耳中GSH的含量明显高于栽培的木耳.利用该方法测定GSH的回收率分别达到94.90%和94.45%，3次测定的标准偏差分别为2.49%和2.52%，基本满足准确分析要求.

图4 GSH含量和色谱峰面积的校正曲线

表1 木耳样品中GSH含量的测定结果

3 结论

1）黑木耳中富含GSH，干品野生木耳的GSH含量为2.354 5 mg／g，干品栽培木耳的GSH含量为1.148 0 mg／g，这表明木耳可作为一种重要的外源性GSH来源的食用菌，其丰富的营养价值和生物学功能可能与其富含GSH有关.

2）野生木耳中的GSH含量高于栽培木耳的GSH含量，说明GSH可能在木耳生长环境抗逆性中起重要作用，即野生种适应在低温、干旱的逆环境中生长可能与其含有较高的GSH含量有关［12］.

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Determination of reduced glutathione inAuriculariaauriculaby HPLC

HAN Ling，HUANG Cheng－ze，ZHANG Xiao－yong＊
（AnalysisandInspectionCenter，YanbianUniversity，Yanji133002，China）

The optimal extraction solvent and isolation condition for Reduced Glutathione（GSH）in wild and cultivatedAuriculariaauriculais investigated，furthermore，the GSH content is determined by High Performance Liquid Chromatography（HPLC）method.The results shows that both the wild and the cultivatedAuriculariaauriculacontains higher GSH content，i.e.，the wildAuriculariaauriculais 2.354 5 mg／g on a dry weight basis，the cultivated is 1.148 0 mg／g.The cause of the higher GSH content for the wildAuricularia auriculaseem related to growing environment.It shows theAuriculariaauriculashould become an important edible fungus for exogenous GSH.

edible fungi；Auriculariaauricula；glutathione；HPLC；bioactivity

R151.3

A

1004－4353（2012）01－0071－04

2011－11－05

＊通信作者：张小勇（1970—），男，实验师，研究方向为色谱分析.