荧光光谱法测定啤酒中核黄素的含量

周丽丽，胡北，崔胜云

（延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林 延吉133002）

荧光光谱法测定啤酒中核黄素的含量

周丽丽，胡北，崔胜云＊

（延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林 延吉133002）

探讨了酸度和光降解作用对核黄素吸收和荧光光谱的影响.利用改进后的荧光光谱法测定了不同品牌啤酒样品中游离核黄素的含量，结果表明，所选啤酒样品中的核黄素含量在0.025 97～0.034 29μg／mL范围内.该方法操作简单、结果可靠，为定量测定基体复杂样品中的核黄素含量提供了新的方法.

核黄素；荧光光谱法；紫外可见光谱法；荧光猝灭

0 引言

核黄素不能在人体内自合成，只能从食物和外源性补充剂中摄取，因此，对食品和药物中核黄素含量的测定具有重要的实际意义.目前，测定核黄素的方法较多，如紫外分光光度法［1］、电化学法［2］、高效液相色谱法［3］、毛细管电泳法［4］、荧光光谱法等，其中荧光光谱法因具有灵敏度高、选择性好等特点而被广泛应用.但在实际样品的测定中由于该方法易受到基体干扰，故需要分离干扰成分等前处理过程，使得分析操作变得繁杂、耗时.根据文献［5－7］报道，连二亚硫酸钠在440～500 nm激发光下，对核黄素产生的绿色荧光具有选择性猝灭作用.鉴于此，本文利用连二亚硫酸钠对核黄素的荧光猝灭作用，即利用猝灭前后荧光强度之差消除样品中荧光的干扰，测定了啤酒中的核黄素含量.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

RF－5301荧光分光光度仪（岛津公司），UV－8500紫外分光光度仪（天美公司），p HS－3C型实验室酸度计.核黄素（Sigma公司），其他试剂皆为分析纯试剂，实验用水为2次蒸馏水.

1.2 核黄素标准储备液的制备

准确称取0.003 8 g经干燥的核黄素粉状结晶，置于100 mL容量瓶，加入p H＝4.5的醋酸－醋

酸钠缓冲液.将容量瓶置于温水中摇动，溶解后冷却至室温，然后移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，放置于冰箱中保存.使用时，用醋酸－醋酸钠缓冲液调节溶液的p H值并稀释至测定浓度.

1.3 样品的处理测定

准确量取2 m L不同品牌的瓶装啤酒样品，加入p H＝4.5的醋酸－醋酸钠缓冲液8 m L，然后用定量滤纸进行减压过滤，再取一定量的滤液放入棕色容量瓶中稀释至刻度作为待测液.

1.4 操作步骤

于激发波长470 nm、发射波长527 nm处测定待测液的荧光强度F0，然后加入2 mg连二亚硫酸钠后再测定其荧光强度F1.待测液中核黄素的荧光发射强度If＝（F0－F1），啤酒样品中核黄素的含量，其中C为由标准曲线回归方程If＝8.993＋34.612C算得的待测液中核黄素的浓度（mol／L），V1为用醋酸 －醋酸钠缓冲液定容的试样体积（0.01 L），V2为样品的体积（2 mL），M为核黄素的相对分子量.

2 结果和讨论

2.1 酸度对核黄素吸收和荧光光谱的影响

Hegemann等［8］研究核黄素的吸收和荧光特性时发现，溶液的酸度对核黄素的吸收和荧光特性具有明显的影响.这是因为核黄素在不同酸度下具有一定的平衡（如图1所示），即在0.2～9.75 p H值范围内是以中性态（RFIoxH）的形式存在，而在强酸和强碱性溶液中，分别是以阳离子态（RFIoxH＋2）和阴离子态（RFI－ox）的形式存在.

图1 不同酸度下核黄素的中性态、阳离子态和阴离子态结构图

为探讨不同酸度下核黄素的光谱性质，配制不同酸度的核黄素溶液分别测定了Uv－vis吸收光谱和荧光光谱（见图2）.图2 A－C的结果表明：核黄素在不同酸度下的Uv－vis吸收光谱都出现了4个明显的吸收峰，其中E带和B带的2个吸收峰是由于苯环的共轭结构引起的，λmax＝351～373 nm的吸收峰是n→π＊电子跃迁所致，而λmax＝443 nm的吸收峰是π→π＊电子跃迁的结果.在可见区443 nm处，核黄素在HAc－Na Ac缓冲溶液中的中性态（RFIoxH）的吸收强度最强，在强酸性溶液（HCl）中的阳离子态（RFIoxH＋2）的吸收强度次之，在强碱性溶液（NaOH）中的阴离子态（RFI－ox）的吸收强度最弱.这一结果说明，强酸或强碱溶液中的离子态核黄素与中性态的核黄素相比其分子轨道特性和跃迁概率都会发生变化，从而导致光谱特性发生改变.图2 A′－C′表明，荧光光谱受酸度的影响更加明显.在激发波长为470 nm时，中性态核黄素的电子密度最大，所以其在527 nm处发射的荧光强度最强；而碱性下阴离子态核黄素的电子密度最小，所以几乎无荧光发射.这可能是由于不同状态下核黄素的分子轨道的电子密度不同而引起轨道能量和跃迁几率发生变化并导致了不同的荧光猝灭作用.

2.2 光降解作用对核黄素吸收和荧光光谱的影响

核黄素在光照下容易发生光解，为探讨光照对核黄素光谱特性的影响，在HAc－NaAc缓冲溶液中，用Uv－vis分光光度法和荧光分光光度法分别测定了光照（白炽灯）前后的光谱图，结果见图3.

由图3A－B可以看出：苯环E带和B带的峰型在光照前后没有发生明显的变化，说明光照可能对核黄素的苯环结构并不发生明显的分解作用.在λmax＝373 nm和λmax＝443 nm处的吸收光谱带发生明显的蓝移，且分别在λmax＝353 nm和λmax＝382 nm处出现新的吸收峰和吸收肩峰，但在波长443 nm以上几乎没有吸收峰.这一结果说明，光照导致了核黄素的分解，并且使其苯环以外的环外共轭结构受到了破坏.由图3 C－D可以看出，光降解后发射的荧光强度大大降低，说明光降解产物几乎无荧光发射.因此用荧光分光光度法测定核黄素含量时，溶液必须得新鲜配制并避光保存，以免光降解作用导致测定的准确度下降.

图2 核黄素的紫外光谱图（A－C）和荧光光谱图（A′－C′）：A，A′为0.1 mol／L HCl；B，B′为0.1 mol／L HAc－NaAc溶液；C，C′为0.1 mol／L NaOH溶液；荧光测定激发波长λex＝470 nm

图3 核黄素的紫外吸收光谱（A，B）和荧光光谱（C，D）：A和（1）为光解前；B和（2）为光解3 d后

2.3 荧光分光光度法测定啤酒中的核黄素含量

2.3.1 标准曲线 取新鲜配制的标准核黄素溶液，测定不同浓度下核黄素溶液的荧光光谱图，并绘制荧光发射强度与核黄素浓度之间的标准曲线（激发波长为470 nm），结果见图4.图4显示，荧光强度与核黄素浓度之间呈良好的线性关系，其线性回归方程为：If＝8.993＋34.612C，相关系数γ＝0.998 88.

图4 核黄素的荧光标准曲线和线性回归方程

2.3.2 连二亚硫酸钠对核黄素的荧光猝灭作用

取一定浓度的核黄素溶液，分别加入不同质量的连二亚硫酸钠（粉末状）并测定其荧光光谱，结果见图5.图5显示，随着加入连二亚硫酸钠质量的增加，荧光发射强度明显降低，当加入量超过2 mg时，荧光发射完全猝灭.因此，本实验中连二亚硫酸钠的用量选定为2 mg.

2.3.3 啤酒中核黄素含量的测定 分别选择6种不同的啤酒样品，测定加入连二亚硫酸钠前后的荧光光谱，结果见图6.

图6显示，在荧光发射光谱图中，所有啤酒样品在527 nm处均有核黄素的特征峰.加入2 mg连二亚硫酸钠后，核黄素的荧光猝灭作用使荧光强度大大降低，但在527 nm处仍有一定强度的荧光发射，说明啤酒样品中仍存在黄素蛋白等干扰成分.根据加入连二亚硫酸钠前后荧光强度的变化计算啤酒样品中核黄素的含量，结果见表1.

图5 激发波长为470 nm时，1×10－6 mol／L核黄素在HAc－NaAc缓冲溶液中的荧光发射光谱（1）和在样品中分别加入0.8、1.2、1.6、2、2.4 mg连二亚硫酸钠时的荧光光谱图（2）－（6）

图6 样品中加入连二亚硫酸钠前后的荧光发射光谱图：（A，A′）、（B，B′）、（C，C′）分别为同一厂家不同品牌的啤酒样品

表1表明，啤酒中核黄素的含量在0.025 97～0.034 29μg／m L范围内.不同厂家啤酒产品中的核黄素含量虽有一些差别，但同一厂家不同品牌（发酵时间不同）的含量差别不大，说明啤酒中的核黄素含量与厂家所用原料中核黄素含量有关，而与发酵时间的长短关系不大.

表1 啤酒样品中的核黄素含量

2.3.4 干扰和回收率 对100倍抗坏血酸、50倍尿酸、100倍半胱氨酸等进行了干扰实验.结果表明加标回收率在93.98%～106.45%，基本满足分析测定的要求.

3 结论

研究表明，酸度对核黄素的紫外光谱和荧光发射光谱有一定的影响，这与不同酸度下核黄素以不同的形态存在有关.中性态核黄素的吸收和荧光特性最好，这可能是因为在强酸或强碱中，离子态的核黄素会改变分子轨道的能量状态，导致跃迁概率降低或系间穿越增多，从而使荧光强度减弱.利用连二亚硫酸钠对核黄素的荧光猝灭作用，测定了不同品牌啤酒样品中游离核黄素的含量，结果表明，本方法操作简便、结果可靠，为定量测定基体复杂样品中的核黄素含量提供了新的方法.

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，1995：816.

［2］杨培慧，周志军，冯德雄，等.玻碳电极吸附循环伏安法测定维生素B2［J］.暨南大学学报：自然科学版，2001，22（5）：93－97.

［3］Cheung R H，Marriott P J，Small D M.CE methods applied to the analysis of micronutrients in food［J］.Electrophoresis，2007，28（19）：3390－413.

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［5］邵晓芬，张韵慧.荧光法测定果蔬中抗坏血酸和核黄素［J］.光谱学与光谱分析，1994，14（2）：125－127.

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［7］谢志鹏，蔡定建，汪敬武.Na2SO3的歧化反应研究及在维生素B2分析测定中的应用［J］.分析实验室，2006，25（10）：95－98.

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Riboflavin analysis in beer using fluorescence spectrometry

ZHOU Li－li，HU Bei，CUI Sheng－yun＊
（KeyLaboratoryofNaturalResourcesoftheChangbaiMountain＆Functional Molecules（YanbianUniversity），MinistryofEducation，Yanji133002，China）

Uv－vis spectrometric and fluorometric properties of riboflavin are investigated in different acidity and light degradation.A modified fluorescence method is used to detect the content of riboflavin in different brands of beer.The results indicated that the content of riboflavin in beers ranges from 0.025 97－0.034 29μg／m L.The method effectively eliminates metrix interferences and applicable to determination complex matrix samples.

riboflavin；fluorescence spectrometry；Uv－vis spectrometry；fluorescence quenching

O656.3

A

1004－4353（2012）01－0078－05

2012－03－05

＊通信作者：崔胜云（1957—），男，教授，研究方向为生物有机分析.