5，5′－二硫硝基苯甲酸的电化学性质及在谷胱甘肽测定中的应用

黄成泽，韩玲，崔胜云

（延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林 延吉133002）

5，5′－二硫硝基苯甲酸的电化学性质及在谷胱甘肽测定中的应用

黄成泽，韩玲，崔胜云＊

（延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林 延吉133002）

利用循环伏安法研究了巯基衍生化试剂5，5′－二硫硝基苯甲酸（DTNB）在玻碳电极上的循环伏安特性.实验发现，DTNB的二硫键在玻碳电极上出现了灵敏的阴极还原电流.通过分析酸度、扫描起始电位、还原型谷胱甘肽（GSH）、扫描次数对DTNB电化学性质的影响，确立了DTNB在电极上各氧化还原峰的归属，并给出了电极的反应机理.根据DTNB二硫键的还原峰电流随GSH浓度的增加其线性降低的特性，建立了伏安法灵敏测定GSH含量的分析方法，该方法的测定结果与常规光度法相吻合.

5，5′－二硫硝基苯甲酸；还原型谷胱甘肽；循环伏安法；电化学分析

0 引言

还原型谷胱甘肽（GSH）在生物细胞内分布较广，其生物学功能包括抗氧化、助氨基酸吸收、抗衰老、抗癌、提高免疫力等［1－3］.由于生物体内GSH含量的变化直接关系到机体的健康和疾病的发生，故检测GSH的含量对疾病的诊断和治疗具有重要的意义.目前，电化学分析方法由于其方法简单、操作简便等优点被广泛应用于微量和痕量成分的测定.文献［4－5］采用滴汞电极和化学

修饰电极的电化学方法测定了GSH的含量，但由于该方法需对电极进行预先化学修饰操作，并且使用有毒的汞作为工作电极，因此给分析工作带来了诸多不便.近年来，利用各种氧化还原媒介体在固体电极上灵敏的电化学响应来间接测定含巯基化合物的方法受到人们的关注.Robin等［6］利用邻二苯酚类物质作为电化学媒介体，通过测定含巯基化合物在玻碳电极表面上与媒介体亲电加成产物产生的电化学响应信号的差异，分别灵敏测定了还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸等含巯基化合物.Richard等［7］采用 N，N－二乙基对苯二胺作为电化学媒介体灵敏测定了半胱氨酸等含巯基化合物.

Ellman试剂（5，5′－二硫硝基苯甲酸，DTNB）通常在PBs缓冲溶液中易与巯基化合物发生衍生化反应.由于DTNB分子中与2个苯环相联的二硫键和苯环上的硝基皆可在固体电极上具有灵敏的电化学响应，同时DTNB与巯基化合物作用生成的3－羧基－4－硝基苯硫酚（TNBA）也可能具有有别于DTNB的电化学特性，这为通过测定DTNB与巯基化合物作用前后的电化学响应的差异来确立含巯基化合物的电化学分析方法提供了可能.Mannino等［8］利用循环伏安法（玻碳电极，p H＝5的缓冲溶液中）对DTNB的电化学性质进行研究发现：DTNB在固体电极上出现了2个阴极还原峰，并认定该峰为硝基的还原峰；当溶液中加入半胱氨酸（Cys）时发生衍生化反应生成TNBA，其硝基阴极还原生成有别于DTNB的灵敏还原电流峰.Mannino等还通过TNBA硝基的还原峰电流与加入的Cys浓度之间的线性关系，建立了定量测定Cys的电化学分析方法.Manino的研究为电化学方法测定巯基化合物提供了新的思路，但对DTNB的电化学性质，如DTNB在固体电极上氧化还原所产生的各峰的归属及酸度对电化学特性的影响，以及其他含巯基化合物的测定方法等未作详述报道.本文以DTNB为电化学媒介体，利用其与巯基化合物衍生化反应前后的伏安特性的变化来测定含巯基化合物，为电化学测定含巯基化合物提供新的思路.

1 实验部分

1.1 仪器

EG＆G M273恒电位仪（美国）；玻碳电极为工作电极；铂为对电极；Ag｜AgCl为参比电极的三电极体系；酸度调节采用p HS－3C型酸度计.CV扫描测定时在起始电位处先静置30 min，然后再进行CV扫描.

1.2 试剂

还原型谷胱甘肽（GSH）为Sigma公司生产，5，5′－二硫硝基苯甲酸（DTNB）为沃凯试剂，质量分数为99.0%，GSH针剂为昆明积大制药有限公司生产，其他试剂均为分析纯试剂，实验用水为3次蒸馏水.

2 结果与讨论

2.1 DTNB的电化学性质

图1为在PBs缓冲溶液中（p H＝6.8），电位窗口为0.50～－1.5 V（vs.Ag｜AgCl）范围内，采用不同起始电位和扫描方向测得的循环伏安图.其中：图1 A的起始电位为－0.3 V，图1B的起始电位为0.5 V；图中箭头所指为扫描方向，扫描速率为100 m V／s；虚线所示的CV图为空白溶液（PBs，p H＝6.8）中测定结果.

图1 DTNB（1.0×10－4 mol／L）在不同起始电位时和不同电位窗口中的CV图

图1 A显示：DTNB在起始电位（－0.3 V）向负向端扫描时，分别在Epc2＝－0.594 V，Epc3＝－0.910 V，Epc4＝－1.458 V处各出现了1个阴极还原峰电流；当电位扫描至CV的正向端时，在Epa1＝0.118 V和Epc1＝0.044 V处各出现1个氧化还原峰.图1 B显示：当起始电位设置为0.5 V并向负向端开始扫描时，CV图中在Epc1＝0.044 V处未出现还原峰，说明对应于峰电位Epa1和Epc1的氧化还原电流是由DTNB的阴极还原产物在固体电极上的氧化还原过程所产生的.图1表明，DTNB在固体电极上至少出现3个阴极还原峰，这可能是DTNB中的还原性基团的阴极还原所致（如二硫键或硝基）.

为了进一步探讨DTNB在固体电极上的阴极还原峰的归属，选择 HAc＋NaAc（p H＝4.5）缓冲溶液作为支持电解质对DTNB进行了CV扫描，结果见图2.其中：图2 A的起始电位为－0.3 V，图2 B的起始电位为0.5 V；图中箭头所指为扫描方向，扫速为100 m V／s；虚线所示的CV图为空白溶液（p H＝4.5）中测定结果.

与图1结果相比较，图2中对应于Epc2的DTNB阴极还原峰电位明显正移，峰电流增大；对应于Epc3的峰电位处未出现峰型，这使得对应于Epc2的还原峰拖尾.同时，对应于Epc4的还原电流出现了明显的峰型，峰电位正移，峰电流增加.图1和图2表明：对应于Epc2和Epc4的DTNB的阴极还原过程有质子参与，而对应于Epc3的阴极还原过程无质子参与.

为了进一步探讨酸度对DTNB电化学性质的影响及DTNB各阴极还原峰的归属，以不同p H值的PBs缓冲溶液作为支持电解质，分别对DTNB进行了CV扫描，结果见图3.

图3 DTNB（1.0×10－4 mol／L）在不同酸度的PBs缓冲溶液中的CV图：A为p H＝7.03；B为p H＝6.63；C为p H＝6.21

图3表明：酸度的提高使对应于Epc2的峰电位正移，同时峰电流逐渐增大；对应于Epc3的还原峰电流随酸度的增大逐渐减小；对应于Epc1和Epa1的氧化还原峰电流随酸度的增加而增大.这一结果与图1和图2的分析结果类似.

DTNB分子骨架中存在硝基和二硫键2个还原性基团，在质子参与下，二硫键阴极还原成巯基，而硝基的阴极还原过程是通过还原生成自由基的分步还原过程［9］，因此酸度的提高有利于二硫键的还原.Sqella［10］和 Paik［11］等在研究硝基咪唑和硝基苯的阴极还原中发现：硝基只在强碱性中产生灵敏的阴极还原电流.

2.2 电极反应机理初探

为了进一步探讨DTNB在固体电极上的电化学反应机理，分别在PBs和HAc－Na Ac缓冲溶液中对一定浓度的DTNB进行连续CV扫描，结果如图4所示.图4显示，随着扫描次数的增加，不同酸度下的DTNB其负电位处的阴极还原峰（Epc2，Epc3，Epc4）电流从第 2 圈扫描开始明显降低，但Epa1和Epc1的氧化还原峰电流和峰型未发生明显的变化.这一结果说明：在第1圈CV扫描过程中，DTNB的阴极还原产物强烈吸附在电极表面上，导致电极的阻抗增加；第2圈扫描开始后，DNBA的阴极还原峰电流明显降低.Epa1和Epc1的峰型和峰电流未随扫描次数的增加而发生明显的变化，这说明Epa1和Epc1峰是还原产物TNBA吸附在电极上的氧化还原峰.由上述结果可推知DTNB在玻碳电极上的氧化还原机理，如图5所示.

图4 DTNB（1×10－4 mol／L）在PBs（p H＝6.8）和Hac＋NaAc（p H＝4.2）缓冲溶液中连续3次扫描的CV图

图5 DTNB在玻碳电极上的氧化还原机理

2.3 GSH对DTNB电化学性质的影响及其测定

GSH和DTNB之间发生二硫键的交换反应并生成新的产物TNBA.由于产物TNBA的硝基更易在阴极还原，故DTNB在电极上的阴极还原电流和峰型会发生明显的变化.图6 A为在1×10－4mol／L DTNB溶液中依次加入0、1×10－5、2×10－5、3×10－5mol／L GSH 后测得的CV图；图6 B为在1×10－4mol／L DTNB溶液中依次加入4×10－5、5×10－5、6×10－5、8×10－5mol／L GSH时测得的CV图.

图6表明，DTNB的二硫键的还原峰（Epc2）随着GSH浓度的增加，其峰电流线性降低，这是由于溶液中GSH和DTNB的反应导致DTNB的浓度降低所致.而对应于TNBA的硝基还原峰（Epc3），当加入的GSH浓度相对较小时，其峰电流不发生线性变化；当加入的GSH浓度相对较大时，其峰电流呈线性增加.这是由于在电极表面和溶液中均生成了TNBA，导致两者还原动力学过程不同所致.因此，根据二硫键的还原峰（Epc2）的峰电流与溶液中GSH浓度之间的线性关系可准确分析测定低含量的GSH.利用该原理测定了临床用针剂中的GSH含量，其校正曲线和测定结果见图7和表1.

图7表明，在过量的DTNB溶液中其二硫键的还原峰电流与加入的GSH浓度呈良好的线性关系，其线性回归方程为ip＝47.605－1.979 86CGSH，相关系数γ＝0.997 8.表1表明，采用标准曲线法测定GSH含量的结果与Uv－vis吸收光谱法相吻合.

图6 DTNB溶液中加入不同浓度GSH时的CV图

图7 在DTNB（1×10－3 mol／L）PBs缓冲溶液中依次加入不同浓度GSH时的二硫键的还原电流（A）及还原峰电流与加入的GSH浓度之间的关系图（B）

表1 针剂中GSH含量的测定结果

3 结论

本文利用循环伏安法对巯基类衍生化试剂5，5′－二硫硝基苯甲酸（DTNB）的电化学性质进行表征发现：DTNB在酸性和近中性溶液中，在固体电极上出现灵敏的二硫键的还原电流和DTNB还原产物TNBA的还原电流；在过量DTNB的溶液中，DTNB的二硫键的还原电流在较宽的浓度范围内随GSH含量的增加呈线性降低.利用上述结果建立了灵敏定量测定GSH的电化学分析方法，用该分析方法测定针剂中GSH含量的结果与光度法相吻合.虽然DTNB和巯基化合物的交换反应无选择性，但是在电极不经任何化学修饰的条件下，利用媒介体在固体电极上灵敏的电化学响应，即可实现简便、灵敏地测定具有生物活性功能的巯基化合物，这为电化学检测巯基类化合物提供了新的思路.

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Electrochemical properties of 5，5－dithiobis（2－nitrobenzoic acid）and application to the determination of glutathione

HUANG Cheng－ze，HAN Ling，CUI Sheng－yun＊
（KeyLaboratoryofNaturalResourcesoftheChangbaiMountain＆Functional Molecules（YanbianUniversity），MinistryofEducation，Yanji133002，China）

Electrochemical properties of 5，5－dithiobis（2－nitrobenzoic acid）（DTNB）are investigated using glassy carbon electrode with cyclic voltammetry.Sensitive reductive current is observed by reduction of disufulde bond on the electrode.Influences of acidity，initial potential，reduced glutathioe（GSH），cycling number on the cyclic voltammograms of DTNB are also investigated and electrochemical mechanism of DTNB on the glassy carbon electrode are proposed accordingly.Linearly decreasing reduction current of disulfide bond of DTNB with the increasing concentration of GSH are observed.According to the linearship between reduction current and GSH concentration，novel electrochemical detection method of GSH are established.The determination results are consistent with those determined by spectrometric method.

5，5－dithiobis（2－nitrobenzoic acid）；reduced glutathion；cyclic voltammetry；electroanalytical chemistry

O657.1

A

1004－4353（2012）01－0059－05

2012－02－26

＊通信作者：崔胜云（1957—），男，教授，研究方向为生物有机分析.