丙烯酰胺单体对人肝细胞作用的实验研究▲

朱格非 麦 慧* 张 驰 傅丽清 滕晓颦

(1广西壮族自治区人民医院整形外科，南宁市 530021;2新西兰奥克兰大学化学科学学院，奥克兰市 1142)

丙烯酰胺单体对人肝细胞作用的实验研究▲

朱格非1麦 慧1*张 驰2傅丽清1滕晓颦1

(1广西壮族自治区人民医院整形外科，南宁市 530021;2新西兰奥克兰大学化学科学学院，奥克兰市 1142)

目的探讨丙烯酰胺单体(acrylamide，AA)对体外培养人肝细胞株(L-02)的生长抑制作用。方法MTT比色法测定不同时间段、不同浓度AA对L-02细胞的生长抑制率，并设对照组，绘制生长抑制曲线。结果经不同浓度(0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%)的 AA作用24 h、48 h、72 h后，与对照组比较，L-02生长抑制率差异均有统计学意义(P＜0.05)。AA对L-02细胞均有明显毒性，表现为细胞增殖抑制作用。结论AA对体外培养的L-02细胞具有增殖抑制作用，且呈时间剂量依赖性。

丙烯酰胺;肝细胞;细胞毒性;MTT法

聚丙烯酰胺水凝胶被证实无毒性［1］，曾被整形美容医师大量应用于注射隆乳，但用于注射隆乳后，仍出现大量术后并发症，如感染、局部疼痛等［2～5］，众多学者对注射隆乳后并发症的原因进行了广泛的探讨和研究。以往的动物实验证实丙烯酰胺单体具有肾毒性，但尚未见其在细胞学水平对肝毒性的相关研究报道。为此本研究以人肝细胞株L-02作为工具细胞，丙烯酰胺单体作用后，MTT比色法检测其对L-02细胞是否具有增殖抑制作用。

1 材料和方法

1.1 受试材料 丙烯酰胺单体(acrylamide，AA MW 71.08，瑞兴科技有限公司)。细胞株:人正常肝细胞株(L-02)(中国医学科学院上海细胞库)。主要试剂:RPMI-1640培养液(赛默飞世尔生物化学制品公司)，小牛血清(Gibco公司)，磷酸缓冲盐PBS(索莱宝公司)，溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT，索莱宝公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，胰蛋白酶(博士德公司)。仪器设备:倒置相差显微镜(OLYMPUS)，CO2恒温培养箱(Thermo Fisher Scien)，超净工作台(上海力申科学仪器公司)，电子分析天平(苏州四海医疗器械有限公司)，气浴恒温振荡器(江苏金坛医疗仪器厂)，全自动酶标分析仪(山东高密彩虹分析仪器公司)。

1.2 药物配制 分析天平精确称量AA，加入磷酸盐缓冲液(PBS)，配制成50%溶液常温避光备用。

1.3 细胞培养 L-02细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、5%CO2、湿度95%条件下静置培养。细胞生长到80%后，加入1 mL消化液(含0.02%EDTA，0.25%胰蛋白酶)消化，待细胞变圆，间隙增大时，弃消化液，注入培养液终止消化，轻轻吹打制成单细胞悬液，1/3比例传代，每3～4 d传代一次。

1.4 AA对L-02细胞的毒性作用 采用MTT比色法，取对数生长期的L-02细胞经0.25%胰蛋白酶消化、吹打分散后计数，配制为细胞密度为8×104/mL的细胞悬液，每孔100 uL接种于96孔板中，分别设置24 h、48 h、72 h培养板。每板分别设有不同剂量药物组、阴性对照组、空白组，每组3个复孔。细胞贴壁后，弃去旧的培养液，更换新的培养液，将AA溶液加入相应各孔，终浓度分别为0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%。药物作用细胞 24 h、48 h、72 h 后，取出培养板，每孔加入5 mg/mL的MTT10 μL，混匀，继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min使结晶充分溶解，酶标仪测每孔光密度(optical density，OD)值，波长490 nm，按以下公式计算抑制率:

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件对实验数据进行处理，实验数据以±s表示，各组间的比较采用单因素方差分析和t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

不用剂量AA作用24 h、48 h、72 h后，对体外培养的L-02均有抑制作用，随着AA浓度的增加，细胞OD值逐步降低，表示细胞受到明显的抑制和破坏。其抑制率呈现明显剂量依赖关系，随着药物剂量增大，其对细胞的生长抑制越强。经统计学分析，药物作用24 h、48 h、72 h时，不同浓度AA对L-02的生长抑制与阴性对照组OD值的差异均有统计学意义(P＜0.05)。而药物作用48 h后，AA在浓度为0.625%时，较24 h对L-02生长抑制率增加，但组间比较无统计学意义(P＞0.05)。药物作用72 h后，AA在各浓度对L-02的生长抑制率均高于90%。见表1、图1。

表1 AA 24 h、48 h、72 h对L-02细胞的生长抑制效应 (±s，n=3)

表1 AA 24 h、48 h、72 h对L-02细胞的生长抑制效应 (±s，n=3)

注:各组生长抑制率与阴性对照组比较:*P ＜0.05，#P ＜0.01。

药物浓度V(%)(μmol/L)24 h OD值 抑制率(%)48 h OD值 抑制率(%)72 h OD值 抑制率(%)0.625(0.012) 0.245 ±0.024 60.65%* 0.125 ±0.015 78.75%# 0.078 ±0.015 93.87%#1.25(0.023) 0.204 ±0.027 67.24%* 0.089 ±0.016 84.83%# 0.074 ±0.060 94.13%#2.5(0.046) 0.146 ±0.044 76.50%# 0.075 ±0.023 87.16%# 0.067 ±0.062 94.71%#5(0.093) 0.131 ±0.052 78.96%# 0.080 ±0.009 86.31%# 0.072 ±0.064 94.34%#10(0.185) 0.113 ±0.076 81.91%# 0.093 ±0.004 84.09%# 0.085 ±0.067 93.26%#20(0.370) 0.062 ±0.144 90.10%# 0.057 ±0.010 90.34%# 0.066 ±0.005 94.81%#阴性对照组0.623 ±0.052 － 0.587 ±0.046 － 1.266 ±0.069 －

图1 不同时间段AA对L-02细胞的生长抑制率

3 讨论

医用填充材料置入人体后，需同体液相接触，聚丙烯酰胺水凝胶(polyacrylamide hydrogel，PAAG)作为高聚合材料，已被广泛证实对人体无明显毒性。国内外多位学者的研究报道认为，PAAG是无毒、无过敏、无致畸、无胚胎毒性、无突变和无降解的，注射入人体后形态自然［6，7］。1997年该产品引入中国后，开始大量应用于注射隆胸或其他软组织填充，2000年开始出现多个案例的术后并发症的报道，主要为急性或无菌性炎症、疼痛、局部肿胀、红肿、穿破或窦道形成等，且注射物易于向组织间隙渗漏。2006年4月30日国家食品药品监督管理局发文全面停止了生产、销售和使用PAAG(注射用)。

目前聚丙烯酰胺水凝胶注射隆乳后产生术后并发症的原因尚未完全清楚。聚丙烯酰胺是无毒的，但其单体并不能完全聚合，残留的AA是有毒的，由此可以推断聚丙烯酰胺这类聚合物是否有毒，以及毒性程度，应取决于AA的残留量。因此国内外众多学者将目光聚焦于人体内单体残留量，大量文献报道对注射治疗后的患者进行体内单体检测，亦未得出明确结论［8］。

通过本次试验发现，AA对人正常肝细胞具有明显的生长抑制作用。药物作用24 h、浓度为0.625%的AA对L-02细胞的生长抑制率即达到了60.65%，浓度为20%的AA的细胞生长抑制率达到68.75%，与对照组的差异具有显著统计学意义。药物作用48 h、浓度为0.625%的AA对细胞的生长抑制率达到78.75%，与对照组的OD值差异具有统计学意义，20%的药物浓度细胞生长抑制率达90.34%。药物作用72 h、0.625%的药物浓度细胞生长抑制率为93.87%，20%的药物浓度细胞生长抑制率达94.81%。AA对L-02细胞的生长抑制率呈现了明显的时间剂量正相关，随着药物剂量增大、药物作用时间延长，其对细胞的生长抑制作用越强，具有明显的细胞毒性。

由此可见，医用聚合物材料置入人体内后，同体液相接触，该聚合物本身没有毒性，引起炎症和组织反应的主要原因是聚合物中的易溶出物质，这些易溶出物质一般包括残留的原料单体及该高聚物内的其他添加剂等等［9］。本研究通过细胞毒性试验证实了AA对L-02具有明显的毒性作用，但也只能反映出PAAG溶出物的毒性情况，但要定量地考察出聚合物溶出物对生物的影响则是比较困难的。国内有学者对聚丙烯酰胺水凝胶注射隆乳患者的注射物中进行丙烯酰胺单体提取，AA提取量均明显小于未植入体内的聚丙烯酰胺水凝胶中单体最低检出量［10］。也就是说在注射人体内后，AA在注射区域的含量明显小于未植入人体前的检出量。此类结果无明显实际意义，因为聚丙烯酰胺水凝胶中的水分在人体组织复杂的生物环境中与体液进行交换，且AA具有水溶性，其可以自由扩散，被组织吸收、代谢使之含量减少，对注射部位AA含量的检测尚不能代表AA对人体的毒性强弱，因此这需要了解注射隆乳的患者术后一定时间内血液中单体的含量，并对血液中的AA含量的检测方法进行探索，并分析这些浓度的溶出物是否会对人体造成毒性反应。AA进入体内后，广泛分布于体液，并可以通过母体进入胎儿体内，其在人体内会产生一系列代谢反应。体内的丙烯酰胺主要与谷胱甘肽结合，反应生成N-醋酸基-S-半胱氨酸，通过其他生物转化途径产生N-甲基丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺，最后从尿液中大量排出，丙烯酰胺及其代谢产物可以与血红蛋白结合，能聚集在神经系统、肝、肾及生殖系统［11］。

综上所述，我们需要建立大样本大型哺乳动物模型，在动物模型身上进行模拟手术，注射一定剂量聚丙烯酰胺水凝胶，喂养一定时间后分不同时间段抽取血液进行AA的检测，了解AA在动物体内含量变化并进行分析，这将是今后研究的重点。

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Study on anti-proliferation effect of acrylamide on human hepatocyte in vitro

ZHU Ge-fei1，MAI Hui1* ，ZHANG Chi2，FU Li-qing1，TENG Xiao-pin1(1.Department of Plastic Surgery，The People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，Guangxi，China;2.School of Chemical Science，the University of Auckland，Auckland 1142，New Zealand)

ObjectiveTo explore the growth-inhibition effect of acrylamide(AA)on human hepatocyte L-02 in vitro.Method Method The growth-inhibition rate of L-02 of different concentration of AA in different time section were tested by MTT method，with L-02 cultured with medium free of AA as control group.Anti-proliferation curves were drawn.Result The anti-proliferation rate of L-02 of different concentration of AA(0.625，1.25，2.5，5，10，20%)in different time section(24h，48h，72h)was different to that of the control(P ＜0.05).AA was showed with apparent cytotoxicity of cytostasis.ConclusionAA has a function of anti-proliferation on L-02 in vitro，and it increases with both time and dose.

Acrylamide;Human hepatocyte;Cytotoxicity;MTT method

R 318.08

A

1673-6575(2012)06-0584-04

广西科学基金(编号:桂科自0991210)

朱格非(1981～)，男，硕士，主治医师，研究方向:软组织修复与重建。*

2012-10-11

2012-11-16)