δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

崔小进，杨帆，戴有金，李章富，吕永通，胡风庆

(辽宁大学生命科学院生物材料与生物制药实验室，辽宁沈阳110036)

Delta-睡眠肽(Delta sleep inducing peptide，DSIP)是一种存在于动物体内的促睡眠物质，由Monnier等［1］于1963年从被微电流刺激的家兔脑静脉血通过体外血液透析等方法分离得到。Delta-睡眠肽为Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu 9个氨基酸所构成，是分子量为848.98 u的九肽［2］。将其注射到动物静脉，可以增强慢波睡眠时相的Delta-波及睡眠梭形活动，即有促进睡眠的作用，故称为Delta-睡眠肽。DSIP作用于睡眠的途径并未得到透彻的研究，一些研究显示DSIP是通过影响脑中血清素(serotonin)和γ-氨基酪酸(GABA)的释放来产生促睡眠作用的［3］。研究还显示内源性的DSIP参与了许多肽类激素的调控:它可以抑制促甲状腺激素、促生长素抑制素的分泌，刺激促黄体激素、生长激素、促生长激素释放激素的分泌［4-5］，此后随着研究的深入，DSIP还被发现具有多种生理功能，因此被视为一种多功能的神经调节肽，这些功能中最显著的生理活性就是其应激保护作用。DSIP作为一种应激限制因子(stresslimiting factor)可以降低环境中紧张因素对机体的损害，人体中内源性DSIP水平在35岁后会有升高来减少应激反应对机体的损害［6］。在免疫应答中，DSIP还可以起到免疫调节剂的作用，并能促进细胞分化兼具有抗肿瘤的作用［7］。DSIP具有降低体温的特性［8］;DSIP还具有舒张血管的活性，高血压的人或老鼠接受DSIP后，血压会下降;DSIP具有调节昼夜节律的作用;DSIP还可以通过增强脑啡肽与鸦片受体的作用而产生镇痛作用;DSIP具有抗酒精和抗鸦片活性，可抑制对于酒精和鸦片的依赖;另外DSIP还具有抗惊厥的作用。由于Delta-睡眠肽在体内的含量极少，分离纯化起来，不但繁琐且非常困难，加之又有了对Delta-睡眠肽一级结构的了解，人们开始试图通过化学合成的方法来获得Delta-睡眠肽，并且取得了一定的成功。早在1979年，就报道了Delta-睡眠肽及其类似物的合成工作［9］。此后，对其合成、生物活性及构效关系的研究均取得进一步发展，为其临床应用提供了进一步的依据。本研究对DSIP基因进行克隆，构建载体pET-28a-DSIP，但由于目的编码区过短，DSIP无法实现表达。在质粒pET-28a-DSIP中插入一段编码含有265个氨基酸残基的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因，通过融合表达的方法成功实现了DSIP的表达，并纯化得到GFP-DSIP融合蛋白，为进一步研究DSIP的生物学作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株原核表达载体pET-28a质粒，购自Novagen公司;pEGFP-C1表达载体以及E.coli BL21(DE3)菌株由本实验室保存。

1.1.2 实验试剂限制性内切酶，T4 DNA连接酶，DNA Marker，均购自TaKaRa公司;小量质粒提取试剂盒，Pfu高保真DNA聚合酶，RNA酶，DNA回收试剂盒，均购自上海生工生物工程公司;B型超纯质粒小样快速提取试剂盒，购自宝信生物技术有限责任公司;亲和层析介质Ni-NTA His-Bind Resin，购自Qiaqing公司;其他试剂为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 SOE PCR扩增DSIP基因序列根据DSIP基因序列设计引物，上游引入编码肠激酶识别位点的碱基序列和EcoRⅠ酶切位点DSIP1:5'-TCCGAATTCGACGACGACGACAAATGGGCTGGTGGTGACGC-3'。下游引入XhoⅠ酶切位点DSIP2:5'-GTGCTCGAGATTATTCACCGGAAGCGTCACC-ACCAGCCCA-3'。利用上述引物进行SOE-PCR拼接延伸出整个DSIP基因及肠激酶识别位点序列。反应条件为95℃5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，用胶回收试剂盒纯化并回收。

1.2.2 表达载体pET-28a-DSIP的构建用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对纯化的DSIP目的片段和pET-28a质粒在37℃双酶切过夜，产物经凝胶电泳后分别纯化回收。在16℃，T4连接酶作用下，将DSIP片段和pET-28a过夜连接，然后转化E.coli BL21(DE3)，筛选阳性转化子，测序鉴定。

1.2.3 绿色荧光蛋白基因的PCR扩增根据GFP基因序列设计引物，上游引入NdeⅠ酶切位点GFP1:5'-GTACATATGATGGTG AGCAAGGGCGAG-3'。下游引入酶切位点BamHⅠGFP2:5'-ATTGAATTCTCTAGATCCGG TGGAGCCC-3'，以质粒pEGFP-C1为模板，通过PCR扩增GFP。反应条件:95℃预变性5 min，94℃变性45 s，58℃退火60 s，72℃延伸45 s，30个循环，最后72℃充分延伸7 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，用胶回收试剂盒纯化并回收。

1.2.4 表达载体pET28a-GFP-DSIP的构建GFP基因PCR扩增产物经限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ双酶切后插入到载体pET-28a-DSIP，然后转化E.coli BL21(DE3)，挑取阳性克隆双酶切鉴定，测序鉴定。

1.2.5 重组质粒的诱导表达将测序鉴定正确的重组质粒转化到BL21表达菌种中，进行诱导表达。菌液经37℃振揺培养过夜后以1∶100比例接种到新鲜培养基中，培养至OD600值约为0.6时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，30℃继续振摇培养4 h，收菌进行聚丙烯凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定诱导表达产物。

1.2.6 融合蛋白的纯化取过夜培养菌液10 mL，接入200 mL含Kan(40 μg/mL)的LB培养基，37℃，200 r/min振荡培养至OD600达到0.6后IPTG诱导蛋白表达，培养结束后离心收集菌体;将菌体重悬于4 mL结合缓冲液中，加入溶菌酶至1 mg/mL，超声破碎菌体后离心去除不溶性细胞碎片。收集上清参照镍亲和层析柱使用说明过镍亲和层析柱纯化融合蛋白。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET28a-GFP-DSIP的构建

2.1.1 DSIP的SOE PCR扩增结果根据设计的引物DSIP1和DSIP2，SOE PCR扩增DSIP，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为57 bp，预期结果基本一致，结果见图1。

图1 SOE PCR扩增DSIP基因结果Fig.1 SOE PCR of DSIP

2.1.2 GFP的PCR扩增结果根据设计的引物GFP1和GFP2，PCR扩增GFP，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小为798 bp，预期结果基本一致，结果见图2。

图2 绿色荧光蛋白基因的PCR扩增结果Fig.2 PCR of GFP

2.1.3 重组质粒的鉴定结果用BamHⅠ和NdeⅠ酶切重组质粒，1%琼脂糖凝胶电泳分析得到789和5 360 bp左右2条条带，与预期相符，该重组质粒经酶切电泳鉴定正确，结果见图3。

图3 pET28a-GFP-DSIP双酶切验证结果Fig.3 Identification of pET28a-GFP-DSIP by digesting with restiction enzymes

对重组质粒中插入的序列进行测序鉴定，经Blast序列分析软件比对，结果表明，GFP以及DSIP基因正确插入到了pET-28a载体中，成功构建了pET28a-GFP-DSIP重组载体。

2.2 重组GFP-DSIP融合蛋白的表达纯化鉴定结果

表达质粒pET28a-GFP-DSIP经1 mmol/L IPTG于30℃诱导4 h，SDS-PAGE结果显示转化表达质粒株菌诱导后有1条明显的融合蛋白表达条带。从图4中可以看出GFP-DSIP融合肽的分子量与预期大小(32 ku)相符。融合蛋白经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化后，在SDS-PAGE中显示出预期大小的纯化后的蛋白条带(图4)。

图4 GFP-DSIP诱导表达及纯化的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE of expression and purification of GFP-DSIP

3 讨论

自从发现Delta-睡眠肽，一些验证DSIP是主要的内源性睡眠因子的假说的研究便被开展起来，人们考虑用它来治疗失眠［10］，很多研究已经证实这一想法。Delta-睡眠肽已经被描绘成一种睡眠促进物质而不是一种镇静剂。

应用现代分子生物学方法和基因工程手段，通过原核表达系统来获得Delta-睡眠肽将为Delta-睡眠肽的内源性和生物合成等一系列问题提供重要的信息，也可能会为Delta-睡眠肽的临床应用提供良好的发展契机，对促进人们对于睡眠的认识将有很大的意义，也将为患睡眠障碍的病人贡献一个新致眠药物提供了可能性。

本研究通过SOE-PCR方法扩增到带有肠激酶识别位点和DSIP九肽的编码序列，经酶切、连接构建表达载体pET-28a-DSIP。以pEGFP-C1为模板扩增出GFP的基因，插入pET-28a-DSIP中构建表达载体pET-28a-GFP-DSIP，转化E.coli BL21(DE3)，利用IPTG诱导表达获得大量可溶性表达产物。可溶性蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化，SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝染色分析，呈现一条带，证明本研究成功构建融合蛋白GFPDSIP，其纯度达电泳纯。

［1］ Monnier M，Koller T，Graber S.Humoral influences of induced sleep and arousal upon electrical brain activity of animals with crossed circulation［J］.Experimental Neurology，1963，8(3):264-277.

［2］ Schoenenberger GA，Monnier M.Charaterization of a delta-electroencephalogram(-sleep-)inducing peptide［J］.PNAS，1977，74(3):1282-1286.

［3］ Schoenenberger GA.Characterization，properties and multivariate functions of Delta-Sleep Inducing Peptide(DSIP)［J］.European Neurology，1984，23(5):321-345.

［4］ Iyer KS，McCann SM.Delta sleep inducing peptide(DSIP)stimulates the release of LH but not FSH via a hypothalamic site of action in the rat［J］.Brain Research Bulletin，1987，19(5):535-538.

［5］ Kovalzon VM.DSIP:a sleep peptide or unknown hypothalamic hormone?［J］.J Evol Biochem Physiol，1994，30(2):195-199.

［6］ Koplik EV，Umryukhin PE，Konorova IL，et al.Delta sleepinducing peptide and deltaran:potential approaches to antistress protection［J］.Neurosci Behav Physiol，2008，38(9):953-957.

［7］ Sukhikh GT，Meerson FZ，Mikhaleva II.Stress decrease in resistance of an organism to a tumor growth and its prevention by central inhibiting metabolites［J］.Dokl Akad Nauk USSR，1984，278(3)253-256.

［8］ Pollard BJ and Pomfrett CJD.Delta sleep-inducing peptide［J］.Eur J Anaesthesiol，2001，18(7):419-422.

［9］ Graf MV，Hunter CA，Kastin AJ.Presences of delta sleep inducing peptide like material in human milk［J］.ClinEndocrinol Metab，1984，59(1):127-132.

［10］ Khvatova EM，Samartzev VN，Zagoskin PP，et al.Delta sleep inducing peptide(DSIP):effect on respiration activity in rat brain mitochondria and stress protective potency under experimental hypoxia［J］.Peptides，2003，24(2):307-311.