利用反向胶束技术从微紫青霉菌中提取木聚糖酶的初步研究

任 敬

(石家庄医学高等专科学校 基础部 生化教研室，河北 石家庄 050071)

利用反向胶束技术从微紫青霉菌中提取木聚糖酶的初步研究

任 敬

(石家庄医学高等专科学校 基础部 生化教研室，河北 石家庄 050071)

目的 利用反向胶束技术从微紫青霉菌中提取木聚糖酶。方法 采用双-2-乙基己基硫代琥珀酸钠(AOT)异辛烷反胶束溶液萃取和反萃取由微紫青霉菌产生的木聚糖酶，探讨水相pH值、离子强度、AOT浓度等因素对分离效率的影响。结果 当AOT浓度为0.6 mol/L，萃取pH 6.0，NaCl浓度为 0.1 mol/L，反萃取 pH 8.0，NaCl浓度为0.5 mol/L，15%乙醇时，该体系从微紫青霉菌澄清发酵液中提取木聚糖酶，萃取率接近100%，反萃取率也在80%以上。木聚糖酶酶比活从27 U/mg提高到208 U/mg，提高了6.7倍，且粗酶纯化后的比活在200 U/mg以上。结论 采用此体系提取木聚糖酶具有较好的工业前景。

木聚糖酶;反胶束;萃取;反萃取;双-2-乙基己基硫代琥珀酸钠

木聚糖酶是一类降解木聚糖分子的复杂酶系，其来源广泛，结构复杂，本身也是一种多功能酶，其用途广泛［1］。

分离纯化木聚糖酶多采用非特异性方法，如硫酸铵沉淀后，采用离子交换、凝胶色谱分离纯化;也有根据特异性分离的方法，如根据木聚糖酶能与底物特异性结合而发展的亲和色谱等［2］，这些方法都存在操作时间长，不易放大的缺点［3］。反胶束是表面活性分子在非极性有机溶剂中自发形成的具有热力学稳定性的纳米级聚集体，其内部形成“水池”，可以溶解水和其他亲水分子(蛋白质等)［4］。反向胶束系统的液液萃取技术在蛋白质的分离纯化方面具有高效、选择性强和连续性好的特点［5］。且近期研究表明表面活性剂双-2-乙基己基硫代琥珀酸钠(AOT)反向胶束萃取方面具有很大的潜力［6］。采用甘蔗渣渣浆酸水解液作为培养环境在Palma等［7］的研究中已经被提到过，然而未见后续报道。本文尝试采用反胶束相转移法萃取和反萃取法提取木聚糖酶，探讨提取的最优条件。

1 材料

微紫青霉菌，中国科学院微生物研究所;桦木木聚糖(90%木糖)、AOT(纯度 ＞99%)、3，5-二硝基水杨酸，Sigma公司;其余化学试剂皆为市售分析纯。

XW-80A微型涡旋混合仪，上海沪西分析仪器厂;TG1650-WS离心机，上海卢湘仪仪器厂;722分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 微生物与生长环境

微紫青霉菌在包含2%葡萄糖、0.25%酵母提取物、2%琼脂以及基于Vogel's培养基的2%的浓盐溶液的培养基上30℃连续培养5 d。菌株所产生的孢子被悬浮于水中，悬浮液通过置于锥形瓶上的筛绢(200目)进行过滤，获得孢子浓度为105/mL。

2.2 甘蔗渣渣浆酸水解液的制备

干甘蔗渣800 g与0.25%硫酸溶液8 L混合，将混合液在121℃下高压蒸煮45 min后将高压处理过的水解液过滤，除去不溶物，用NaOH溶液调节pH 至 5.5。

2.3 木聚糖酶的制备

培养用培养基由甘蔗渣渣浆水解液以及基于Vogel's培养基的2%的浓盐溶液和0.1%的酵母提取物构成。培养基采用112℃，15 min热压消毒，后倒入125 mL锥形瓶中进行培养。每一个锥形瓶倒入培养基25 mL。培养环境为:温度30℃、初始pH 5.5、60 r/min 振荡培养96 h。

2.4 萃取与反萃取

2.4.1 发酵液初次酶活测定 在对澄清发酵液实施萃取与反萃取之前，需对澄清发酵液中所包含的木聚糖酶进行一次活性的测定，以此作为确定萃取收率与反萃取收率的参考。

2.4.2 萃取与反萃取 通过存在于异辛烷中的AOT反向胶束系统，酶被从澄清的发酵液中提取出来，整个过程包含两个步骤。在第一步当中，木聚糖酶溶液4 mL与等体积胶束微乳液(AOT反向胶束存在于异辛烷中)进行混合，通过加入磷酸缓冲液调节水相的pH。通过强烈的涡旋5 min，使两相的分配达到平衡。离心处理(3 000 r/min，5 min)，使两相分开，测定水相中酶的活性，计算萃取收率。第二步则是取包含木聚糖酶的有机相2 mL与水相(1 mol/L 醋酸缓冲液，pH 5.5，含 0.5 mol/L NaCl)2 mL混合，同时加入15%的乙醇，涡旋5 min，使之充分混合;通过离心(3 000 r/min，5 min)最终将酶从胶束中转移到水相中。测定水相中酶的活性，计算反萃取收率。

2.4.3 酶活性的测定 取0.5%桦木木聚糖溶液(用 pH 4.6，50 mmol/L 醋酸缓冲液配制)1 mL，加入酶液0.5 mL，55℃保温30 min后加入DNS试剂3 mL终止反应，然后在沸水浴中煮15 min。冷却，加水至25 mL，混匀，于550 nm波长处比色，用煮沸20 min的酶液作对照。活性单位是在50℃下，每1 min每1 mL酶液水解木糖1μmol所相当的酶量［8］。

3 结果和讨论

3.1 萃取时间的影响

利用反向胶束系统从微紫青霉菌发酵液中提取木聚糖酶的萃取率以及反萃取率与萃取时间的关系见表1。萃取和反萃取均在2 min内即可达到平衡，故本实验所有的数据都是在混合时间大于2 min的条件下取的，以确保数据的准确性。

表1 涡旋混合时间的影响

3.2 AOT 的影响

配制不同浓度的AOT反向胶束溶液，对微紫青霉菌发酵澄清液进行萃取与反萃取。其中反向胶束系统 NaCl浓度为0.1 mol/L，pH 为6.0。

从图1中可以看出，在较低浓度时，萃取率随着AOT浓度的增加而迅速提高。可能是因为增加表面活性剂的浓度会使反向胶束的聚集数增加，还能增加反向胶束相整体的极性，从而增加酶蛋白增溶到反向胶束中的机会。当AOT浓度达到0.6 mol/L时，萃取率可达95%以上。

图1 AOT浓度对萃取率的影响萃取(萃取C NaCl=0.1 mol/L，pH 6.0)

当AOT浓度超过0.6 mol/L时，萃取率变化趋势趋于平缓，并且萃取后水相出现乳化现象，可能是因为表面活性剂浓度相对酶浓度已经达到饱和，通过增加有机相中的表面活性剂已经不能显著的改善萃取的效果。并且过多的表面活性剂会直接导致其从有机相中的析出，以至于发生乳化的现象。因此，实验选择的最适表面活性剂AOT浓度为0.6 mol/L。

3.3 水相pH的影响

水相pH值的变化对萃取率有明显的影响。如图2所示，在pH 5.0～6.0的范围内，反向胶束体系对木聚糖酶有很高的萃取率，都达到了90%以上。并且随着pH的降低，萃取率逐渐升高，最高接近100%。pH值对萃取率的影响主要表现在改变蛋白质的表面电荷及其对构象的改变。pH值决定了酶蛋白带电基团的解离速率和所带的静电荷。静电作用是萃取的主要作用力，在pH＜pI时，酶蛋白带正电荷，和阴离子表面活性剂极性头互相吸引。pI和pH的差值越大，静电作用越强，萃取效果越好。

图2 萃取水相pH值对萃取率与反萃取率的影响(C AOT=0.6 mol/L，萃取 C NaCl=0.1 mol/L，反萃取 C NaCl=0.5 mol/L，pH 8.0，乙醇体积分数 15%)

萃取水相pH对反萃取率的影响见图2。在pH＞6.0时，随pH下降，反萃取率不断增加，在6.0时达到峰值，在pH＜6.0时，反萃取率反而下降。可能是因为萃取时，pH和pI的差值越大，酶和表面活性剂极性头间的静电引力就越大，结合就越牢固，导致在反萃取时不容易分开。

我们注意到pH值在2.9以下时，有机相中将出现稳定的乳状物，对于木聚糖酶的提取将无法进行。另一方面，当pH值大于9.8时酶蛋白将在水相与有机相的交界处以沉淀的形式析出。对于以上观察到的现象我们认为，这可以归因于酶蛋白与表面活性剂形成了复合结构，从而导致其变性。

3.4 盐浓度的影响

图3显示了不同盐浓度对木聚糖酶萃取率的影响。当盐浓度较低时，木聚糖酶几乎全部被萃取;当盐浓度高于一定值时，萃取率迅速下降，并且在很窄的范围内从100%迅速降到0，所以离子强度对蛋白质萃取率的影响相当强烈。一个相对低的离子强度的条件对于木聚糖酶的萃取无疑是有利的，但是离子强度并不是越低越好，在很低的盐浓度时，水相乳化严重。并且盐浓度越高，分相越快越清晰。

图3 盐浓度对萃取率以及反萃取率的影响(C AOT=0.6 mol/L，萃取 pH=6.0，反萃取 pH 8.0，乙醇体积分数 15%)

我们同时还注意到在反萃取过程中盐浓度的变化对于反萃取率的改变不甚明显。在这里我们主要考虑的是实验方案的经济程度以及反萃取过程的分相效率问题。

3.5 反萃取中乙醇的影响

陈霖杰［9］在对用AOT/异辛烷反向胶束体系从胰酶粗提物中萃取胰蛋白酶进行的研究中指出，通过在反向胶束相加入乙醇可以解决反向胶束萃取蛋白质时使蛋白质变性失活的问题，胰蛋白酶的前萃取率达到90%，反萃取率接近100%。

我们在实验中注意到如果反萃取时不加入乙醇，几乎得不到有活性的酶，加入乙醇，使木聚糖酶的反萃取率得到了明显的提高。究其原因，可能是因为乙醇的加入使得蛋白质和反向胶束内表面之间的作用减弱，从而使蛋白质更易从反向胶束中迁移出来，同时减少酶和表面活性剂极性头之间强烈的静电作用而导致的蛋白质变性。此外，乙醇的加入也使得萃取之后的分相变得更加容易。但过量乙醇的加入，会导致反萃取率下降。其原因可能是因为乙醇改变蛋白质的电荷特性，引起其沉淀析出。根据图4结果，确定乙醇的体积分数为15%。

图4 反萃取中乙醇对反萃取率的影响(C AOT=0.6 mol/L，萃取 C NaCl=0.1 mol/L，pH=6.0，反萃取 C NaCl=0.5 mol/L，pH 8.0)

3.6 木聚糖酶初酶的纯化

对于存在于微紫青霉菌澄清发酵液中的初酶，按照最佳条件:CAOT=0.6 mol/L，萃取 CNaCl=0.1 mol/L，pH 6.0;反萃取 CNaCl=0.5 mol/L，pH 8.0，乙醇体积分数15%，进行萃取与反萃取，萃取率为93%，反萃取84%，比活从27 U/mg提高到208 U/mg，提高了6.7倍。一步从微紫青霉菌发酵液中分离出木聚糖酶，反向胶束技术取得了较好的效果，为以后进一步的精提做好了准备。

利用该体系提取木聚糖酶还有以下特点:一步就可以从粗酶中提取到较纯的木聚糖酶，提取时间短，提取可在室温下进行，AOT廉价易得，有机溶剂可循环使用。本体系的粗酶来源简单，产量丰富，所运用的培养基方便易得且经济成本相对低廉，可以为工业生产提供良好的基础。

［1］马文静，张美云，房桂干.木聚糖酶的应用研究进展［J］.江苏造纸，2008(1):20-24.

［2］孙 雷，朱孝霖，李 环，等.木聚糖酶分离纯化技术［J］.生物技术通报，2005(5):52-54.

［3］苏玉春，陈 光，白 晶，等.双水相法提取木聚糖酶的初步研究［J］.食品科学，2009，30(5):214-216.

［4］刘海远，陈复生，布冠好，等.反胶束技术及其萃取蛋白质的研究进展［J］.农产品加工，2010，(11):43-45.

［5］王金枝，曹学君.反胶束萃取技术分离胰激肽原酶［J］.中国生物工程杂志，2007，27(3):93-99.

［6］Brandani V，Di Giacomo G，Spera L.Extraction of protein a-amylase protein by reverse micelles:II Effect of pH and ionic strength［J］.Process Biochem，1994(29):363-367.

［7］Palma M B，Milagres A M F，Prata A M R，et al.Influence of aeration and agitation rate on the xylanase activity from Penicillium janthinellum［J］.Process Biochem，1996，31(2):141-145.

［8］朱启忠，韩晓弟，赵 宏，等.青霉菌m8产胞外木聚糖酶的纯化及其性质研究［J］.微生物学杂志，2004，24(5):68-70.

［9］陈霖杰.用乙醇消除AOT/异辛烷反胶束体系萃取过程中蛋白质的变性失活［D］.上海:华东理工大学，2005.

Extracting xylanase from Penicillium janthinellum using AOT-reverse micellar systems

REN Jing
(Biochemical Department of Shijiazhuang Medical College，Shijiazhuang 050071，China)

TQ464.8

A

1005-1678(2012)02-0167-03

2011-11-21

任 敬，女，本科，助教，研究方向:生化教学。