腺病毒载体左侧反向末端重复区对下游基因表达特异性的影响

徐远玲，张旭东，马宏宝#

1)郑州大学生物工程系郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州 450052

#通讯作者，男，1957年4生，博士，教授，研究方向:生物化学，E-mail:mahongbao@zzu.edu.cn

腺病毒载体左侧反向末端重复区对下游基因表达特异性的影响

徐远玲1)，张旭东2)，马宏宝1)#

1)郑州大学生物工程系郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州 450052

#通讯作者，男，1957年4生，博士，教授，研究方向:生物化学，E-mail:mahongbao@zzu.edu.cn

腺病毒;左侧反向末端重复区;绿色荧光蛋白

目的:研究腺病毒载体左侧反向末端重复区(ITR)对下游基因表达特异性的影响。方法:采用分子生物学方法及Gateway技术构建正反2个方向含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子及GFP报告基因的重组腺病毒载体。以含CMV启动子及GFP报告基因的重组腺病毒载体和不含任何启动子只含GFP报告基因的重组腺病毒载体作对照。重组腺病毒质粒经PacⅠ线性化后用脂质体转染法转染293A细胞，包装并扩增出重组腺病毒颗粒，TCID50测得滴度后分别以相同的感染复数感染4种肿瘤细胞，观察荧光表达情况。结果:携带正向和反向hTERT启动子的重组腺病毒载体在各细胞中荧光表达量无差异，无启动子的重组载体在腺病毒增殖比较强的细胞中有微弱荧光表达。结论:重组腺病毒左侧ITR能够影响上下游特异启动子及其调控基因表达，但对上下游基因的影响程度无明显差异，并且左侧ITR具有类启动子功能。

近年来，重组腺病毒载体逐渐成为目前应用最广泛的基因治疗载体之一。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)在90%以上肿瘤细胞中的活性是增高的，而在绝大多数体细胞中无活性，因此hTERT启动子常作为肿瘤特异性启动子应用于条件复制型腺病毒来进行基因治疗的研究［1］。腺病毒基因组两端各有一个反向末端重复区(inverted terminal repeat，ITR)，是腺病毒复制必需的顺式作用元件。其中左侧ITR含有增强子区域，对下游基因转录有着比较显著的影响［2］。作者构建了正反2个方向含hTERT启动子的腺病毒表达载体，以CMV启动子和反向不含启动子的腺病毒表达载体为对照，通过比较各载体荧光表达情况来研究ITR对下游基因表达特异性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 携带CMV启动子和E1a基因的入门载体质粒pENTR-CMV-E1a，携带GFP和IRES基因片段的质粒载体pIRES-GFP，大肠杆菌DH5α、TOP10及人胚肾293A细胞、人鼻咽癌CNE细胞、人骨肉瘤U-2OS细胞、人乳癌435S细胞、人胰腺癌Panc1细胞，均为郑州大学特聘教授韩志强实验室保存。T4 DNA连接酶、限制性内切酶、去磷酶、pMDTM-18-T载体均购自宝生物工程有限公司，胎牛血清购于HyClone公司，LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司，各试剂盒均购于美国Axygen公司，PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 pMD-T-hTERT载体构建 用基因组DNA小量抽提试剂盒，从293A细胞中提取人基因组DNA。根据GenBank中hTERT基因序列，设计引物，序列如下:上游引物5’-TTTGGATCCCGATTCGACCTCTC TCCGCTGGGGC-3’，下游引物5’-TTTCTCGAGCAG GGCTTCCCACGTGCGCAGCAG-3’。以人基因组DNA为模板，PCR反应扩增403 bp的hTERT启动子基因片段。反应条件为:95℃5 min;95℃30 s，65℃30 s，72℃1 min，30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用胶回收试剂盒回收目的片段，并用TA克隆方法连接到pMDTM-18-T载体上，转化至大肠杆菌TOP10，氨苄抗性筛选后提质粒，酶切鉴定得到的阳性菌落送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果经BLAST序列比对后与GenBank中hTERT启动子序列相吻合，从而获得含有403 bp的hTERT启动子基因的pMD-T-hTERT载体。

1.3 携带hTERT启动子的正反2个方向入门载体的构建 用HincⅡ和XhoⅠ酶切pMD-T-hTERT，胶回收420 bp的hTERT基因片段。用XmnⅠ和XhoⅠ酶切pENTR-CMV-E1a，胶回收4 737 bp的DNA片段为载体。过夜连接后，产物转化感受态DH5α，卡那抗性菌落筛选后酶切鉴定，正确菌落为正向入门载体 pENTR-hTERT-E1a。用 MluⅠ和BamHⅠ酶切pENTR-hTERT-E1a，胶回收2 516 bp含hTERT启动子和 E1a基因的目的片段。用BamHⅠ和PstⅠ酶切pENTR-hTERT-E1a，胶回收2 146 bp的DNA片段为载体，去磷后与先前回收的含hTERT启动子和E1a基因的目的片段连接、转化，卡那抗性菌落筛选后酶切鉴定，得到反向入门载体pENTR-rhTERT-E1a。

1.4 携带CMV反向入门载体的构建 用BamHⅠ和BglⅡ酶切pENTR-CMV-E1a，分别回收3 203 bp含CMV启动子及E1a基因的目的片段和2 641 bp的载体片段。载体去磷后与目的片段连接、转化，卡那抗性菌落筛选后酶切鉴定，得到反向入门载体pENTR-rCMV-E1a。

1.5 携带GFP报告基因的各入门载体的构建 用SalⅠ和XhoⅠ酶切pIRES-GFP质粒，胶回收1 362 bp含GFP-IRES基因的目的片段。用XhoⅠ分别酶切pENTR-hTERT-E1a、pENTR-rhTERT-E1a、pENTRCMV-E1a、pENTR-rCMV-E1a质粒，胶回收线性DNA片段为载体，分别去磷后与含GFP-IRES基因的目的片段连接、转化，卡那抗性菌落筛选后酶切鉴定，得到携带GFP的入门载体pENTR-hTERT-GFPIRES-E1a、pENTR-rhTERT-GFP-IRES-E1a、pENTRCMV-GFP-IRES-E1a 和 pENTR-rCMV-GFP-IRESE1a。用 SpeⅠ和 XhoⅠ酶切 pENTR-rCMV-GFPIRES-E1a，胶回收6 267 bp的DNA片段为载体，补平后自连，转化，卡那抗性筛选后酶切鉴定，得到不含启动子只含GFP的入门载体pENTR-rGFP-IRESE1a。

1.6 腺病毒重组与包装 将构建好的入门载体pENTR-hTERT-GFP-IRES-E1a、pENTR-rhTERT-GFPIRES-E1a、pENTR-CMV-GFP-IRES-E1a、pENTR-rCMV-GFP-IRES-E1a和 pENTR-rGFP-IRES-E1a用Gateway技术通过LR反应与DEST重组，然后转化至TOP10，氨苄抗性菌落筛选后酶切鉴定。分别获得重组腺病毒质粒Adv-hTERT-GFP-IRES-E1a、AdvrhTERT-GFP-IRES-E1a、 Adv-CMV-GFP-IRES-E1a、Adv-rCMV-GFP-IRES-E1a及 Adv-rGFP-IRES-E1a，再用PacⅠ酶分别酶切，使其线性化，暴露ITRs端，在脂质体LipofectamineTM2000的介导下转染293A细胞，转染12 d后80%细胞出现细胞病变反应时，收集细胞及培养液于无菌离心管中并放置于－80℃冷冻柜中30 min，然后37℃水浴15 min解冻。重复此步骤2次。0.22 μm过滤后至无菌离心管中保存于－80℃。第1代病毒病毒滴度低，将其重新感染293A细胞，使其大量扩增，获得高滴度第2代病毒，用 TCID50方法测定滴度并分别命名为hTERT、rhTERT、CMV、rCMV和rGFP。

1.7 重组腺病毒感染肿瘤细胞后的荧光表达情况

取对数生长期的CNE、435S、Panc1和U-2OS细胞，分别按1×105孔－1加于24孔板，以293A细胞作对照。过夜培养后，按感染复数(multiple of infection，MOI)值为1分别加入重组腺病毒hTERT、rhTERT、CMV、rCMV和rGFP。培养2 d后观察重组腺病毒在各细胞中的荧光表达情况。

2 结果

2.1 入门载体的鉴定 pENTR-hTERT-E1a质粒用SacⅡ和 SacⅠ酶切鉴定，pENTR-rhTERT-E1a和pENTR-rCMV-E1a用EcoRⅤ和XhoⅠ酶切鉴定，pENTR-hTERT-GFP-IRES-E1a、pENTR-rhTERT-GFPIRES-E1a和pENTR-CMV-GFP-IRES-E1a用EcoRⅤ和KpnⅠ酶切鉴定，pENTR-rCMV-GFP-IRES-E1a用HindⅢ酶切鉴定，pENTR-rGFP-IRES-E1a用NdeⅠ和XhoⅠ酶切鉴定。各入门载体的酶切鉴定结果见图1，其中泳道1为阳性克隆。

2.2 重组腺病毒包装、滴度测定及荧光表达 重组腺病毒转染293A细胞12 d后80%细胞出现细胞病变反应。5种重组腺病毒的第2代病毒滴度均约为9.4×1012pfu/L。在MOI值和感染时间相同的条件下，在各细胞中，CMV表达的荧光较rCMV略强，hTERT表达的荧光较 rhTERT略强，rGFP在293A及Panc1细胞中表达很微弱的荧光(图2)。

3 讨论

目前，腺病毒载体因其各方面的优点逐渐成为基因治疗中应用最广泛的一种病毒载体。CMV启动子是启动真核基因表达的最强启动子，并被广泛应用于构建高效真核表达载体，是比较理想的阳性对照。GFP是从水母中分离出来的一种具有自发荧光的小分子蛋白质，具有可视性强、不需要外源底物等优点作为报告基因广泛应用于细胞学的研究［3］。该实验所构建的重组腺病毒载体均以GFP为报告基因，其在293A细胞中的包装情况很容易通过荧光显微镜来观察，并为病毒滴度测定带来很大方便，在重组腺病毒感染靶细胞时，也很容易观察其感染效率。

作者构建的以上5种携带GFP报告基因的重组腺病毒载体，以相同的MOI分别感染CNE、435S、Panc1、U-2OS及293A细胞，感染相同的时间后，发现正向和反向携带CMV启动子的重组腺病毒在各细胞中均表达很强的荧光，正向比反向略强。携带hTERT启动子的重组腺病毒在U-2OS细胞无荧光表达(因U-2OS细胞是端粒酶阴性细胞)。而在其他4种细胞中均有荧光表达，正向略强于反向。无启动子的重组腺病毒载体，只在293A及Panc1细胞中表达非常微弱的荧光。而携带启动子的腺病毒载体在293A及Panc1细胞中表达的荧光亮度比其他3种细胞都较强。以上结果表明，重组腺病毒左侧ITR对下游基因的表达影响不会因下游基因的方向倒转而消失。并且，左侧ITR也可能有天然启动子的功能，使得下游基因在没有启动子的情况下也能微量表达。目前，已有研究［4］表明，腺病毒ITR有启动子活性，并且也有研究［5］指出，在牛的3型腺病毒中，左侧ITR包含有E1a的惟一启动子。该实验构建的无启动子的载体，报告基因在左侧ITR下游是反向的，其在腺病毒增殖较强的细胞中能表达荧光的现象进一步证明了在左侧ITR区下游倒转目的基因，并不能使其对下游基因表达的影响消失。

相关实验［6］表明在条件复制型腺病毒表达载体中用hTERT启动子来控制基因的表达是一种很有前景的肿瘤靶向性基因治疗策略。而腺病毒基因组两端的末端重复序列ITRs是腺病毒复制必需的顺式作用元件，其左侧ITR是影响外源基因表达的重要原件之一，影响了左侧ITR下游的由hTERT启动子控治的治疗基因的特异性表达，如何避开此类影响成为亟待解决的问题。

总之，该实验的研究结果证明，在重组腺病毒左侧ITR下游倒转目的基因的方向并不能很好地避开ITR的影响。

［1］董翠，阴志刚，王纯耀，等.人端粒酶逆转录酶启动子调控的真核荧光表达载体的构建与表达［J］.郑州大学学报:医学版，2010，45(3):448

［2］Li C，Hirsch M，Carter P，et al.A small regulatory element from chromosome 19 enhances liver-specific gene expression［J］.Gene Therapy，2008，16(1):43

［3］Ehrhardt D.GFP technology for live cell imaging［J］.Curr Opin Plant Biol，2003，6(6):622

［4］Yamamoto M，Davydova J，Takayama K，et al.Transcription initiation activity of adenovirus left-end sequence in adenovirus vectors with e1 deleted［J］.J Virol，2003，77(2):1633

［5］Xing L，Tikoo SK.E1A promoter of bovine adenovirus type 3［J］.J Gen Virol，2006，87(12):3539

［6］Jacob D，Davis J，Zhu H，et al.Suppressing orthotopic pancreatic tumor growth with a fiber-modified adenovector expressing the TRAIL gene from the human telomerase reverse transcriptase promoter［J］.Clin Cancer Res，2004，10(10):3535

Influence of the left ITR in recombinant adenovirus vectors on the expression of downstream genes

XU Yuanling1)，ZHANG Xudong2)，MA Hongbao1)1)Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)Department of Oncology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

Adenovirus;inverted terminal repeat;green fluorescent protein

Aim:To study the expression of specific gene downstream of the left inverted terminal repeat(ITR)in adenovectors.Methods:Construct a series of recombinant adenovirus vectors that contains green fluoresent protein(GFP)and hTERT promoter and recombinant adenovirus vectors containing the same transgene but in different orientations.The virus control group that contains CMV promoter and the other one which contains non-promotor.The recombinant adenovirus plasmids were digested with PacⅠand transferred into 293A cells mediated by Liopfectamine2000 to package recombinant adenovirus particles and then titrated using 50%tissue culture infective dose(TCID50)assay.All of the virus infected four tumor cell whith the same MOI and the green fluorescence was observed by fluorescent microscopy.Results:By statistical analysis，the fluorescent in each group does not exist significant difference and The faint fluorescent can be observed in the cell in which adenovirus absence of promoter.Conclusion:The enhancer elements of the left ITR in recombinant adenovirus effect the expression of the upstream gene and downstream gene but the influence does not exist significant difference.Studies by this experiment have also demonstrated that the left ITR contains cryptic transcription start sites.

R730.5

(2010-11-01收稿 责任编辑赵秋民)