食管鳞状细胞癌组织中RASSF1A蛋白的表达*

秦艳茹，乔俊静，汤 虹，李芳芳，艾教育

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州450052 2)河南省肿瘤医院肿瘤内科郑州450008

(2011-02-13收稿 责任编辑 姜春霞)

食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，它的发生发展是与遗传因素、环境因素等多因素、多步骤相关的过程，在这个过程中可能涉及多个癌基因的激活和抑癌基因的失活。RAS相关区域家族1A(RASSF1A)基因是最近确定的一种候选抑癌基因，研究［1-2］表明，RASSF1A在正常组织中100%表达，而在许多肿瘤组织中存在较高的表达缺失，且RASSF1A在体外和体内均能抑制肿瘤生长。目前对ESCC组织中RASSF1A基因的研究主要集中在RASSF1A的甲基化改变。该研究用免疫组化方法检测组织芯片中245例ESCC组织和正常食管黏膜组织中RASSF1A蛋白的表达情况，以探究RASSF1A表达与ESCC发生发展和5 a生存率的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 ESCC组织及正常食管黏膜组织均取自河南省林州市人民医院2001年至2007年存档标本。245例ESCC患者中男111例，女134例;年龄＜60岁131例，≥60岁114例;高分化28例，中分化163例，低分化54例;TNM分期(2002年AJCC分期)Ⅰ期13例，Ⅱ期148例，Ⅲ期84例;大体分型:髓质型134例，溃疡型71例，缩窄型15例，蕈伞型25例;有淋巴结转移109例，无淋巴结转移136例。正常食管黏膜组织201例。患者术前均未接受任何放化疗，所有标本经组织病理学检查证实为原发性ESCC。

1.2 组织芯片制作 收集常规病理切片，在切片上根据形态学特点确定具有代表性的肿瘤部位，用组织阵列仪(广州浩翰仪器有限公司生产)定位后，用穿刺取样针在供体蜡块相应的位置进行穿刺取样。预先制备一个45 mm×20 mm大小的受体蜡块，用穿刺取样针打出间距为1.8 mm、直径为1 mm、深度为3～4 mm的孔。然后，将穿刺所得的微小圆柱形组织挤压到受体蜡块上已制备好的阵列孔中。

1.3 2种食管组织中RASSF1A蛋白的检测 采用ABC法。兔抗人RASSF1A单克隆抗体购自Ebioscience公司，ABC试剂盒购自Vector Laboratories公司，DAB底物试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，小牛冻干血清蛋白(BSA)购自美国Sigma公司。严格按照试剂盒说明书步骤操作。一抗按1∶1 000稀释，采用生产第二抗体的正常动物血清封闭非特异性免疫球蛋白反应与省略第一抗体作为空白对照，采用已知的阳性切片作阳性对照。阳性染色标准:以胞质出现黄棕色染色为阳性细胞，高倍镜下计数5个视野，黄染细胞＞5%判为阳性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0进行分析，应用χ2检验比较正常和ESCC组织、不同病理特征ESCC组织中RASSF1A蛋白阳性表达率的差异，检验水准α =0.05。

2 结果

2.1 正常食管黏膜和ESCC组织中RASSF1A蛋白表达情况 ESCC组织中RASSF1A蛋白阳性表达率为46.9%(115/245)，正常食管黏膜组织中为73.1%(147/201)，2组比较差异有统计学意义(χ2=31.263，P ＜0.001)。见图1。

图1 正常食管黏膜和ESCC组织中RASSF1A蛋白免疫组织化学染色(ABC，×100)A:正常食管黏膜组织;B:ESCC组织。

2.2 RASSF1A蛋白表达与ESCC患者临床病理特征的关系 结果见表1。

表1 RASSF1A蛋白表达与ESCC患者临床病理特征的关系

2.3 RASSF1A蛋白表达与ESCC患者5 a生存率的关系 RASSF1A蛋白阴性表达的ESCC患者的5 a生存率低于RASSF1A蛋白阳性表达的患者，见图2。

图2 RASSF1A阴性和阳性表达患者的5 a生存率曲线图

3 讨论

RASSF1A是Dammann等［3］2000年克隆出的候选抑癌基因，其cDNA序列中含有6个外显子，共1 873 bp核苷酸，编码含340个氨基酸的阅读框架，产物为相对分子质量38 800的蛋白质。目前认为，RASSF1A蛋白可能是一种参与细胞周期调控的重要抑制蛋白，其通过多种途径抑制细胞生长、促进细胞凋亡和衰老。RASSF1A蛋白表达缺失或降低可导致肿瘤的发生。

该研究发现，与正常食管黏膜组织相比，ESCC组织中RASSF1A蛋白阳性表达率降低;且与ESCC的淋巴结转移和TNM临床分期有关。这一结果说明RASSF1A阳性表达率降低导致淋巴结转移进而影响预后;且可能参与了ESCC的发展过程，随着肿瘤的进展，RASSF1A的阳性表达率降低。推测可能通过以下机制发挥作用:①RASSF1A作为 Ras蛋白的效应器，与凋亡前激酶 MTS1结合，促进细胞凋亡;RASSF1A阳性表达率降低可能破坏了Ras的平衡作用，使Ras更多发挥促进细胞生长的作用，导致细胞的恶性转化和肿瘤的发生［4］。②RASSF1A可能通过微管结合中心体和纺锤体的功能，进而调节微管的稳定性;RASSF1A还能与CDC20相互作用，导致后期促进复合物(APC)活性受到抑制，从而使细胞有丝分裂停滞在中后期［5］。③RASSF1A可以抑制CyclinD1的积聚，使细胞周期停滞在G1/S期，对细胞增殖起负性调节作用［6］。

该研究发现RASSF1A蛋白阴性表达的ESCC患者的5 a生存率低于阳性表达者，说明RASSF1A蛋白阴性表达的肿瘤比RASSF1A蛋白阳性表达的肿瘤更具有侵袭性和转移性，RASSF1A蛋白阴性表达对瘤细胞恶性侵袭的抑制作用减弱，导致肿瘤转移进而影响预后。

近来研究［7-8］证明，人类多数肿瘤组织中RASSF1A基因启动子区域的CpG岛存在高频率的甲基化，甲基化可能是RASSF1A基因失活的重要机制，与食管癌的发生也密切相关。由此作者推测，RASSF1A基因启动子的甲基化和缺失共同导致了ESCC的发生发展。

综上所述，RASSF1A蛋白阴性表达与ESCC的预后密切相关，RASSF1A蛋白的表达异常可能与ESCC的淋巴结转移、TNM分期和5 a生存率有关。检测RASSF1蛋白表达对ESCC的诊断有一定的临床价值，并且可能作为ESCC患者预后判断的标志之一。

［1］ Lee JJ，Geli J，Larsson C，et al.Gene-specific promoter hypermethylation without global hypomethylation in follicular thyroid cancer［J］.Int J Oncol，2008，33(4):861

［2］ Donninger H，Vos MD，Clark GJ.The RASSF1A tumor suppressor［J］.JCell Sci，2007，120(Pt 18):3163

［3］ Dammann R，Li C，Yoon JH，et al.Epigenetic inactivation of a RASassociation domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3［J］.Nat Gene，2000，25(3):315

［4］ Agathanggelou A，Honorio S，Macartney DP，et al.Methylation associated inactivation of RASSF1A from region 3p21.3 in lung，breast and ovarian tumors［J］.Oncogene，2001，20(12):1509

［5］ Song MS，Song SJ，Ayad NG，et al.The tumour suppressor RASSF1A regulates mitosis by inhibiting the APC-Cdc20 complex［J］.Nat Cell Biol，2004，6(2):129

［6］ Shivakumar L，Minna J，Sakamaki T，et al.The RASSFIA tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclinD1 accumulation［J］.Mol Cell Biol，2002，22(12):4309

［7］ Wong WL，Tao Q，Fu L，et al.Aberrant promoter hypermethylation and silencing of the critical 3p21 tumour suppressor gene，RASSF1A，in Chinese oesophageal squamous cell carcinoma［J］.Int J Oncol，2006，28(3):767

［8］何雪云，何晓燕，毛建生，等.食管癌组织RASSF1A的表达及其与基因启动子甲基化的关系［J］.现代实用医学，2010，22(10):1089