河南汉族精神分裂症患者线粒体DNA 7445和5178位点突变分析*

曹玉媛，张景亮，徐朝阳，程晓丽#

1)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室郑州450001 2)郑州市精神防治医院精神科郑州450005

(2010-12-24收稿 责任编辑 赵秋民)

精神分裂症(schizophrenia，SZ)是一种严重的全球性常见精神疾病，临床表现为思维、情感、行为等多方面的障碍及精神活动不协调，个体终生患病率约为1.0%。SZ是一种多基因病，其遗传度达80.0%，发病机制有神经递质紊乱论、神经发育障碍论和免疫论等［1］。新近 Doi等［2］和 Lauritzen 等［3］从不同的角度分别证实了线粒体在该病中的作用，且Jou等［4］认为应该把精神疾病当作一种代谢病，建议以提升能量代谢、减少氧化应激伤害为治疗手段，至此，线粒体致病理论开始广受关注，线粒体基因突变与精神类疾病发生、发展关系的研究也成为病因学研究的新热点。线粒体 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)7445、5178 等位点与SZ发生关系的研究尚未见报道，作者以此为切入点进行研究，评价其在SZ发生中的作用，为SZ的诊断、治疗及预防提供分子生物学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择河南汉族健康无关个体305例(对照组)，男162例，女143例，年龄19～55岁;296例散发SZ病例(患者组)，男158例，女138例，年龄18～54岁，根据《美国精神障碍诊断统计手册》第3版修订本(DSM-Ⅲ-R)标准确诊为SZ患者，排除伴有严重躯体疾病和脑器质性障碍的患者。患者或其监护人及健康人均对该研究知情同意。

1.2 mtDNA 7445和5178位点突变分析 抽取研究对象外周静脉血3～5 mL，EDTA抗凝，无菌管－20℃保存。采用标准酚/氯仿法抽提总DNA，752型分光光度计对DNA含量及纯度进行测定。mtDNA 7445和5178位点引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。mtDNA 7445上游引物序列:5’-CTTCCCACAACACTTTCTCGG-3’，下游引 物 序 列:5’-GTAAAGGATGCGTAGGGATG-3’;mtDNA 5178上游引物序列 5’-CTTAGCATACTCCT CAATACCC-3’，5’-CTGAATTCTTCGATAATGGCC CA-3’。PCR反应体系为25μL;PCR反应条件:95℃预变性4 min;94℃变性30 s，退火温度mtDNA 7445 59.9 ℃，mtDNA 5178 58.4 ℃ 30 s，72 ℃ 延伸30 s，共25个循环;最后72℃延伸5 min。PCR结束后，对扩增产物进行限制性片段长度多态性分析。另取PCR扩增产物，用限制性内切酶XbaⅠ(Fermentas公司，酶切 mtDNA 7445)和 AluⅠ(Fermentas公司，酶切mtDNA 5178)分别对PCR产物进行消化，37℃4 h 15 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，mtDNA 7445酶切后野生型mtDNA片段长度为400和262 bp，突变型为662 bp;mtDNA 5178酶切后野生型mtDNA片段长度358 bp，突变型为307和512 bp。

1.3 DNA序列测定 采用随机数字表选取正常和突变个体各3例的PCR产物，由中美泰和生物技术公司进行纯化测序。用Chromas读取测序结果，Clustal X软件进行多重序列完全比对，以mtDNA剑桥标准序列为参照。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析，应用χ2检验分析2位点突变发生率的差异，检验水准α =0.05。

2 结果

mtDNA 7445和5178位点的突变分析见图1、2。2组中未见mtDNA 7445突变型存在;对照组中检测出mtDNA 5178 C→A突变69例，SZ患者中检测出 88例，2组比较差异有统计学意义(χ2=3.931，P=0.047)。测序结果见图 3，3 例 mtDNA 7445样本测序结果均见正常XbaⅠ酶酶切识别序列，无突变存在。

3 讨论

mtDNA突变能导致多种遗传性疾病，累及高能耗的大脑、神经、肌肉等不同组织器官，且同一突变可引发多种不同疾病，同一疾病又可由多种不同突变诱导。Chen等［5］研究发现mtDNA 7445位点可发生A→C或A→T突变。mtDNA 7445位点位于线粒体tRNAser(UCN)基因3’末端，是RNAseP剪切识别点，突变将影响基因的正常转录、转录后修饰等，最终影响线粒体自身多种蛋白质合成，导致细胞氧化磷酸化功能受损及ATP合成不足等。作者对296例SZ患者mtDNA 7445位点检测未发现有突变存在，因此认为其可能与SZ的发生无关，此结果有待于进一步扩大样本量进行研究证实。

近来mtDNA 5178基因突变与各种疾病发生、发展关系的研究成为一个新的热点，已发现mtDNA 5178位点可能与人类血脂、血压及糖尿病等有一定关系［6］。Washizuka 等［7］对日本双向情感障碍患者的研究认为此位点突变是风险因子。mtDNA 5178位点位于ND2基因上，ND2基因为线粒体电子呼吸链上复合体Ⅰ的编码基因之一［8］。突变型(mtDNA 5178 A)可导致位于线粒体膜上NADH脱氢酶的第237位氨基酸位点发生亮氨酸到蛋氨酸的转变。两氨基酸含有不同的侧链集团，前者具有脂肪族侧链，后者则含甲硫集团。突变可影响NADH脱氢酶的生化特性，进一步影响糖代谢及氧化应激水平。Kato等［9］研究发现mtDNA 5178 C→A与人格发育有关。该研究发现突变mtDNA 5178 A基因在SZ患者中占29.7%，而在对照组中占22.6%，两者相比差异有统计学意义，提示mtDNA 5178A可能是SZ的风险因素。

［1］张景亮，程晓丽，刘淑莲，等.线粒体 DNA3243、3316、3394位点、突变与精神分裂症相关分析［J］.第二军医大学学报，2011，32(2):179

［2］ Doi N，Hoshi Y，Itokawa M，et al.Persistence criteria for susceptibility genes for schizophrenia:a discussion from an evolutionary viewpoint［J］.PLoSOne，2009，4(11):e7799

［3］ Lauritzen KH，Moldestad O，Eide L，et al.Mitochondrial DNA toxicity in forebrain neurons causes apoptosis，neurodegeneration，and impaired behavior［J］.Mol Cell Biol，2010，30(6):1357

［4］ Jou SH，Chiu NY，Liu CS.Mitochondrial dysfunction and psychiatric disorders［J］.Chang Gung Med J，2009，32(4):370

［5］ Chen J，Yuan H，Lu J，et al.Mutations at position 7445 in the precursor of mitochondrial tRNA(Ser(UCN))gene in three maternal Chinese pedigrees with sensorineural hearing loss［J］.Mitochondrion，2008，8(4):285

［6］Lal S，Madhavan M，Heng CK.The association of mitochondrial DNA 5178 C＞a polymorphism with plasma lipid levels among three ethnic groups［J］.Ann Hum Genet，2005，69(Pt 6):639

［7］ Washizuka S，Ikeda A，Kato N，et al.Possible relationship between mitochondrial DNA polymorphisms and lithium response in bipolar disorder［J］.Int J Neuropsychopharmacol，2003，6(4):421

［8］吴俊涵，刘书莲，程晓丽，等.河南汉族精神分裂症患者mtDNA5351位点突变与GRIK2基因两位点多态性检测［J］.郑州大学学报:医学版，2011，46(1):71

［9］ Kato C，Umekage T，Tochigi M，et al.Mitochondrial DNA polymorphisms and extraversion［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2004，128B(1):76