硫化氢延迟预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞的保护作用*

李双凤，冉 珂，王亚平，唐正国，肖艳英，王 丹

1)中南大学湘雅二医院麻醉科长沙410011 2)长沙市第三医院麻醉科 长沙410011

(2010-08-06收稿 责任编辑 赵秋民)

硫化氢(H2S)作为第三种气体信号分子，近来在心血管系统中的价值备受关注，研究［1］发现H2S可减轻细胞内钙超载，并能激活细胞信号通路［2］，发挥心肌保护作用。H2S是至今发现惟一的内源性血管平滑肌细胞线粒体敏感性钾通道(mitochondrial ATP sensitive potassium channel，mitoKATP)开 放剂［3］。作者探讨H2S预处理的延迟相对大鼠心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)损伤的改善作用及mitoKATP对此作用的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 硫氢化钠和mitoKATP阻滞剂5-羟葵酸(5-HD)均购自美国Sigama公司，Bcl-2、Bax大鼠单抗IgG和辣根酶标记山羊抗大鼠IgG购自Santa Cruz公司，GAPDH大鼠单抗IgG购自美国ProMab公司。

1.2 动物分组 健康成年雄性SD大鼠(32只，体质量300～320 g)由湖南斯莱景达实验动物有限公司提供，采用随机数字表将大鼠分为4组，每组8只。假手术组(Sham组):行冠脉穿线但不结扎;心肌缺血再灌注组(IR组):开胸结扎左冠前降支(LAD)30 min，松解后再灌注2 h;H2S预处理组(H2S组):静脉注射硫氢化钠50μg/kg，24 h后同IR组处理;5-HD+H2S组(5-HD组):缺血前15 min静脉注射5-HD(5 mg/kg)，其他同H2S组处理。

1.3 IR模型的建立［4-5］大鼠经腹腔推注30 g/L戊巴比妥钠麻醉(30 mg/kg)，多导联心电监测。气管插管，动物呼吸机控制呼吸，潮气量8～10 mL/kg，频率70 min－1。在心尖搏动最明显处之上一肋间隙开胸，切开心包，确认左冠圆锥支，在圆锥支之后用7号丝线结扎LAD，立即可见左室前壁紫绀充血，心率减慢，血压一过性下降，心电图监测ST段明显抬高，确认阻断成功。

1.4 各组大鼠心肌细胞超微结构的观察 在再灌注末通过颈静脉注射氯化钾0.1 g处死大鼠，每组取2只大鼠，剪取心脏，在冠脉结扎处下0.5 cm处剪取约1 mm3左心室组织，体积分数为2.5%戊二醛固定2 h后，送湘雅医学院超微病理室，经清洗、固定、梯度脱水、包埋后，在80℃恒温箱内放置10 h聚合，修组织块，做超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅双重染色各10 min，用荷兰FEITecnaiG212型透射电镜观察心肌超微结构，并拍片。

1.5 各组大鼠心肌Bcl-2及Bax蛋白的检测 参考文献［6］提取心肌蛋白。以GAPDH作为内参，进行蛋白半定量分析:取50μg蛋白质样品，加膜再生液煮沸变性后，进行120 g/L SDSPAGE电泳;再电转移至NC膜;用含5 g/L脱脂奶粉的PBS(pH 8.0)封闭2 h;分别加入适量Bcl-2或Bax大鼠单抗IgG(按1∶500稀释)或大鼠GAPDH单抗IgG(按1∶8 000稀释)，摇床上室温反应2 h;洗膜3次，20 min/次;加辣根酶标记山羊抗大鼠 IgG(按1∶50 000稀释)，室温反应2 h;洗膜后进行ECL化学发光，X片曝光显影;用Gel pro 4.0凝胶光密度分析软件进行分析，测其积分光密度(integrating optical density，IOD)值。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组大鼠心肌细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 H2S预处理对IR损伤大鼠心肌细胞超微结构的影响 Sham组心肌细胞超微结构正常。IR组心肌肌原纤维排列紊乱、大面积断裂、融合、消失，肌节结构不清;线粒体形态异常，排列紊乱，肿胀，消失成空泡。H2S组心肌肌原纤维排列较整齐，肌节长短较一致，明带、暗带仍可见;线粒体轻度肿胀，膜较完整，少量融合形成空泡。与IR组相比，线粒体损伤程度明显减轻。5-HD组与IR组差异不大(图1)。

图1 各组大鼠心肌细胞超微结构(—:2μm)A:Sham组;B:IR组;C:H2 S组;D:5-HD组。①:线粒体;②:肌原纤维;③:空泡。

2.2 H2S预处理对IR损伤大鼠心肌组织Bcl-2及Bax蛋白表达的影响 见图2、表1。

图2 H 2 S预处理对IR损伤大鼠心肌组织Bcl-2及Bax蛋白表达的影响

表1 H 2 S预处理对IR损伤大鼠心肌组织Bcl-2及Bax蛋白表达的影响

3 讨论

H2S在体内可能存在2种形式，在pH值为7.4的生理条件下，以H2S和HS－2种形式形成一种动态平衡，保证H2S在体内的稳定，维持内环境pH值稳定［7-8］。硫氢化钠溶液与内源性H2S的体内存在方式相似，而且硫氢化钠的浓度便于精确定量H2S含量，因此，硫氢化钠溶液是较理想的外源性H2S供体。Elrod等［9］在大鼠IR时用10～500μg/kg的硫氢化钠注入左心室进行研究，发现H2S呈剂量依赖性地保护左室功能，减少心肌梗死面积和炎症反应，减少线粒体损伤;而且发现50μg/kg硫氢化钠为改善心肌IR损伤的最佳剂量。Pan等［10］通过比较硫氢化钠延迟预处理与后处理2种方案，发现在心肌梗死前1 d给予单剂量硫氢化钠比梗死后连续3 d给予能更好地保护心肌。因此，该实验采用剂量为50μg/kg的硫氢化钠在缺血前24 h进行延迟预处理方案。

Bcl-2家族分为抑凋亡基因(包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w 等)及促凋亡基因(包括 Bax、Bad、Bcl-xs等)。Hochhauser等［11］用转基因鼠实验证实Bax高表达可促进心肌细胞凋亡，且其表达的程度与心肌凋亡的程度呈正相关。Bcl-2和Bax以同源或异源二聚体形式发挥作用，当Bax高表达时，形成同源二聚体Bax/Bcl-2促进凋亡;Bcl-2高表达时，形成异源二聚体Bcl-2/Bax抑制凋亡发生。该研究结果表明硫氢化钠作为H2S供体能够降低心肌组织Bax的表达，提高Bcl-2表达，从而产生抗凋亡作用。IR引起心肌凋亡是导致移植心脏功能丧失的重要病理生理学基础［12］。IR可引起大量自由基的产生，导致线粒体膜通透功能的改变，进而引起线粒体途径的凋亡。

作者的研究结果表明，给予5-HD后，H2S预处理减轻大鼠心肌IR损伤的效应被取消，而且导致心肌组织中Bcl-2表达下调和Bax表达上调，提示激活mitoKATP后导致Bcl-2上调和Bax表达下调参与了H2S延迟预处理减轻大鼠心肌IR损伤的效应。

通过电镜观察，IR预处理可减轻大鼠心肌细胞线粒体损伤程度，给予5-HD后，线粒体形态异常，排列紊乱，肿胀，消失成空泡，与IR组线粒体损伤程度相当。这间接说明激活mitoKATP参与了H2S的心肌线粒体保护功能。

总之，该实验表明H2S延迟预处理能够减轻大鼠心脏IR损伤，这种改善作用可能与减少细胞凋亡及激活mitoKATP有关。但细胞损伤可能还存在不依赖mitoKATP的其他途径，因此，H2S对心肌保护作用的机制还有待进一步研究。

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［4］汪宝军，付润芳，岳云霄，等.巴戟天寡糖对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响［J］.郑州大学学报:医学版，2010，45(5):792

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