NAC拮抗As2O3对外周血淋巴细胞的毒性作用

李彩丽，魏虎来，苏海翔

砷化合物是一种具有毒性的物质，易与体内含巯基的酶结合而抑制酶活性，可与DNA聚合酶结合，影响DNA合成、修复，诱导染色体畸变和DNA损伤。同时砷也是人体必需的微量元素之一，适量的砷能剌激机体造血和促进细胞生长等［1］，但过量摄入会对人体产生免疫抑制等毒性作用［2］。As2O3作为一种有效的抗肿瘤药物已广泛应用于白血病和实体瘤的治疗中，研究证实［3－4］As2O3可诱导耐药白血病细胞凋亡。我们的前期研究证实［5］As2O3对外周血淋巴细胞具有毒性效应，机制可能与其抑制Bcl-2表达有关。本研究进一步观察As2O3对淋巴细胞的毒性作用以及N-乙酰-L-半胱氨酸(N acetylcysteine，NAC)的拮抗保护效应。

1 材料与方法

1.1 试剂 As2O3为 Sigma公司产品，配成 10 mmol·L－1贮备液;NAC购于上海源聚生物科技有限公司，用生理盐水配成2 mol·L－1的贮存液;淋巴细胞分离液(上海第三生化试剂厂);碘化丙锭(Propidium iodide，PI)、DCF-DA 和 RPMI 1640为 Sigma公司产品;新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所;异硫氰酸荧光素(FITC)标记鼠抗人Bcl-2单抗和鼠IgG1为美国Caltag实验室产品;FITC-Annexin V/PI试剂盒购自Biovision公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血淋巴细胞分离 抽取健康人外周血10 ml，肝素抗凝。加入等量淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypague，d=1.077g·ml－1)，室温、1 500 r·min－1离心30 min，吸取中间界面层淋巴细胞。用RPMI 1640洗涤2次，用1%台盼蓝染色计数活细胞数应大于95%。

1.2.2 人外周血淋巴细胞体外培养 正常人外周血淋巴细胞用含15%新生牛血清、1×105U·L－1青霉素和链霉素的RPMI 1640稀释成3×108·L－1后接种于96孔细胞培养板(Costar公司)中，分别加入1 ～50 μmol·L－1As2O3、2 mmol·L－1NAC 和1 ～50 μmol·L－1As2O3+2 mmol·L－1NAC，置 37℃、5%CO2培养箱中培养24、48和72 h，台盼蓝染色计数活细胞数，计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50)。

1.2.3 Annexin-V/PI 染色检测细胞凋亡 按文献［6］的方法收集不同浓度As2O3和(或)2mmol·L－1NAC作用48 h后的淋巴细胞，调整细胞浓度至1 ×109·L－1，PBS 洗涤，用 500 μl结合缓冲液重悬细胞，加 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，避光室温放置5 min，流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)检测细胞凋亡。

Tab 1Effect of arsenic trioxide and/or NAC on proliferation of lymphocytes(±s，n=4)

Tab 1Effect of arsenic trioxide and/or NAC on proliferation of lymphocytes(±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs As2O3

Concentration As2O3/mmol·L －1 Inhibition rate/%24 h Without NAC added With NAC added 48 h Without NAC added With NAC added 72 h Without NAC added With NAC added 0 2.4 ±0.2 2.1 ±0.3 4.1 ±0.67 3.6 ±0.81 8.2 ±0.1.20 7.5 ±1.50 5 37.8 ±4.86 16.3 ±2.23＊＊ 45.1 ±5.26 24.6 ±3.58＊＊ 56.4 ±5.30 34.6 ±7.15*10 51.5 ±7.13 24.2 ±3.75＊＊ 64.0 ±6.53 37.7 ±4.24＊＊ 77.2 ±6.08 42.1 ±6.39＊＊20 70.0 ±8.72 35.9 ±5.61＊＊ 83.6 ±7.11 43.3 ±6.36＊＊ 90.2 ±5.57 48.0 ±9.88＊＊

1.2.4 电镜观察细胞形态学改变 收集经As2O3单独及与NAC联合处理的细胞，按文献［7］方法常规固定和包埋，在透射电镜(JEM 1230，日本电子公司)下观察淋巴细胞的凋亡形态学变化和超微结构。

1.2.5 细胞内ROS水平检测 参照文献［8］。分别收集As2O3单独及与NAC联合作用12 h和24 h后的淋巴细胞1×109·L－1，PBS洗涤。细胞重悬于1 ml PBS中，加入10 mmol·L－1DCF-DA使其终浓度达 100 μmol·L－1，37℃孵育 1 h 后 FCM 检测。

1.2.6 Bcl-2蛋白表达水平测定 参照文献［9］。分别收集As2O3单独及与NAC联合作用48 h后的外周血淋巴细胞1×109·L－1，PBS洗涤。分别加入细胞固定剂和通透剂，再加入FITC标记的鼠抗人Bcl-2单抗染色，FITC标记的鼠IgG1同型抗体为对照，FCM检测Bcl-2蛋白表达阳性率和平均荧光强度。

2 结果

2.1 NAC对As2O3抑制外周血淋巴细胞生长的拮抗作用 不同浓度的As2O3对正常人外周血淋巴细胞的生长有明显的抑制效应，并呈现明显的浓度与时间依赖关系。而2 mmol·L－1NAC与5～20 μmol·L－1的 As2O3联合作用 24、48 和 72 h，可拮抗As2O3对淋巴细胞的毒性作用，尤以24 h的保护效应最为明显(Tab 1，P ＜0.05～0.01)。

2.2 NAC拮抗As2O3对淋巴细胞的凋亡诱导作用

2.2.1 Annexin-V/PI双标记染色 FITC-Annexin V/PI双标记染色法检测表明5.0 μmol·L－1As2O3作用于淋巴细胞48h后，总凋亡率达89.2%，比对照组提高了 56 倍。2 mmol·L－1NAC 与 5 μmol·L－1As2O3联合作用后，存活细胞明显增多，细胞总凋亡率较As2O3单独作用降低了22%(Fig 1)。

Fig 1 The antagonism of NAC on apoptosis of lymphocytes induced by arsenic trioxideA:Control;B:2 mmol·L －1NAC;C:5 μmol·L －1As2O3;D:2 mmol·L －1NAC+5 μmol·L －1As2O3

2.2.2 细胞形态学改变 电镜观察，外周血淋巴细胞经不同浓度的As2O3处理后，凋亡及死亡细胞多见，细胞呈现体积缩小、胞质浓缩、染色体聚集、固缩、沿核膜内侧分布等较为典型的凋亡细胞特征性形态改变。而采用NAC拮抗后，死亡细胞明显减少，细胞凋亡形态学改变不明显(Fig 2)。

2.3 细胞内活性氧(ROS)水平的变化 As2O3可增高淋巴细胞内ROS水平(P＜0.01)，NAC则降低细胞内ROS水平。而NAC与As2O3联合作用，细胞内ROS水平较As2O3单独作用明显降低(P＜0.01)，2 mmol·L－1NAC+5 μmol·L－1As2O3联合作用12 h和24 h分别降低37.4%和39.4%，而2 mmol·L－1NAC+10 μmol·L－1As2O3联合作用12 h和24 h则分别降低33.3%和39.1%(Fig 3)。

2.4 细胞Bcl-2蛋白表达的改变 As2O3明显降低淋巴细胞Bcl-2蛋白的表达水平，而NAC与As2O3联合则可拮抗As2O3所致淋巴细胞Bcl-2表达的降低，其中2 mmol·L－1NAC 与5 μmol·L－1As2O3联合作用48 h较 5 μmol·L－1As2O3单独作用增高15.2%(Fig 4)。

Fig 2 Morphologic change of lymphocytes after administration of NAC or/and arsenic trioxide(×15 000)

Fig 3 Effect of NAC and/or arsenic trioxide on ROS level in lymphocytes±s，n=4)A:5 μmol·L －1As2O3;B:10 μmol·L －1As2O3;C:2 mmol·L －1NAC;D:2 mmol·L －1NAC+5 μmol·L －1As2O3;E:2 mmol·L－1NAC+10 μmol·L－1As2O3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs A;△△P＜0.01 vs B

3 讨论

As2O3是目前临床有效的抗肿瘤药物，在白血病和实体瘤治疗中得到广泛应用。有研究发现［2］砷在体内外对人和实验动物的淋巴细胞生长均有较明显的抑制作用，其机制可能与砷诱导细胞凋亡有关。我们的前期研究结果［5］证实，As2O3在体外能明显抑制外周血淋巴细胞的生长，且抑制程度呈剂量依赖关系。本实验证实As2O3诱导淋巴细胞凋亡的同时，增高淋巴细胞内ROS水平和降低细胞Bcl-2蛋白的表达水平。

ROS是真核细胞有氧呼吸时的产物，在细胞凋亡的过程中扮演着重要角色。ROS可降低细胞内抗氧化物的有效性而使细胞的氧化还原状态失衡，并可直接或间接改变线粒体膜电位等，从而促进细胞凋亡［10］。Bcl-2位于线粒体、核膜和内质网等，是维持细胞生长的主要蛋白，主要通过减少氧自由基的产生，稳定线粒体膜，阻断Ca2+的跨膜转运等抑制细胞凋亡，促进细胞增殖［11］。NAC作为一种抗氧化剂和自由基清除剂，能够减轻药物或毒物对DNA的损伤，拮抗细胞毒物质所致的细胞凋亡［12］。本研究中NAC可降低淋巴细胞内ROS和促进Bcl-2蛋白的表达;NAC与As2O3联合应用，可拮抗As2O3所致淋巴细胞内ROS的增加和Bcl-2蛋白表达的抑制，保护或减轻As2O3对淋巴细胞的凋亡诱导作用。综上所述，As2O3主要通过诱导凋亡途径对淋巴细胞产生毒性效应，机制可能与其增高细胞内ROS水平和抑制Bcl-2蛋白表达有关;NAC可通过清除细胞内ROS和促进Bcl-2蛋白的表达而拮抗As2O3对淋巴细胞的诱导凋亡作用。

Fig 4 Expression of Bcl-2 in lymphocytes after treatment of NAC and/or arsenic trioxideA:Control;B:2 mmol·L －1NAC;C:5 μmol·L －1As2O3;D:2 mmol·L －1NAC+5 μmol·L －1As2O3

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