普伐他汀对人内皮祖细胞一氧化氮合成的影响

肖刚峰，张怀勤

(1.宁波市第二医院血液科，浙江 宁波 315000； 2.温州医学院附属第一医院心脏中心，浙江 温州 325000)

普伐他汀对人内皮祖细胞一氧化氮合成的影响

肖刚峰1，张怀勤2

(1.宁波市第二医院血液科，浙江 宁波 315000； 2.温州医学院附属第一医院心脏中心，浙江 温州 325000)

目的观察普伐他汀对人内皮祖细胞(EPCs)一氧化氮(NO)合成的影响。方法密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,培养7 d 后,收集贴壁细胞并分别加入普伐他汀，10 μmol/L及100 μmol/L 干预48 h , 免疫组化、荧光显微镜和流式细胞仪鉴定EPC , 用RT-PCR 方法测定对细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS) mRNA 表达的影响,并用硝酸还原酶法测定培养液中一氧化氮(NO)的水平。结果普伐他汀组的人内皮祖细胞eNOS mRNA 的表达、NO 的合成明显增加。结论普伐他汀可增加人内皮祖细胞eNOS mRNA的表达和NO 的合成。

普伐他汀; 内皮祖细胞; 一氧化氮; 一氧化氮合成酶

近年来研究发现他汀类药拥有独立于降脂外的多项心血管保护作用，它能上调成熟血管内皮细胞eNOS的活性和NO的合成[1]。但对血管内皮的前体细胞—内皮祖细胞的eNOS活性和NO合成有没有影响呢？我们特对此做了研究，现报道如下。

1 材料和方法

1.1材料 外周血取自成年健康男性，约70 ml。60 g/L羟乙基淀粉购自Sigma公司，VEGF购自PeproTech EC公司，纤维连接蛋白购自Roche 公司， PE- 抗CD34单克隆抗体购自CALTAG LABORATORIES， FITC-抗VE-Cadherin(钙黏着蛋白)单克隆抗体购自 Bender systemTM公司， PE-抗VEGFR-2(血管内皮生长因子受体2)单克隆抗体、FITC-抗CD133单克隆抗体购自R&D1公司。胎牛血清、胰酶、Hank′s液、D-Hank′s液、PBS均购自Gibco公司，培养基M199购自Sigma公司。DiI-ac-LDL(荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白)购自Molecular probe 公司，普伐他汀由浙江大学医学院心血管病研究所惠赠。胃癌细胞株(SGC7901)购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。VIII因子相关抗原免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。一氧化氮测试盒购自南京建成生物工程研究所。RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。eNOS PCR引物购自上海生物工程有限公司(eNOS 5-GGTCGCTTCGACGTGCT-3，5-TCCCCATTCCCAAATGTGCT-3，884bp)，GAPDH引物购自PCR-Select cDNA Subtraction Kit(Clontech公司)。

1.2人外周血EPCs培养 取新鲜外周血70 ml，以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，以3×106/ cm2密度接种于包被有纤维连接蛋白的24孔培养皿中，每皿加入1 ml包含有20%胎牛血清、VEGF(10 ng/ml)，青霉素(100 IU/ml)及链霉素(100 IU/ml)的M199，置37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。3 d后，洗去未贴壁细胞，添加培养液继续培养。

1.3EPCs鉴定 在培养的第6天细胞以0.25%胰酶消化后，制成1×106/ml的单个细胞悬液，加入荧光标记的抗CD34 、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133单克隆抗体各10 μl(1 mg/ml)，流式细胞仪分析细胞CD34 、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133的表达。为验证培养细胞吞噬DiI-ac-LDL，将DiI-ac-LDL以2.4 μg/ml的终浓度加入培养液，与细胞避光共孵育4 h，多聚甲醛固定10 min,加入FITC-UEA-1(10 μg/ml)孵育1 h。荧光显微镜下观察细胞双荧光。为验证细胞表达Ⅷ因子相关抗原，将培养细胞固定，灭活内源性过氧化物酶，加正常山羊血清封闭，1:1 000一抗4 ℃孵育过夜，加二抗及SABC液于37 ℃烤箱各孵育20 min，加A、B、C混合液显色。空白对照不加一抗，阴性对照采用SGC7901。

1.4分组 在培养的第6天用含3%胎牛血清的培养液培养细胞24 h，之后以0.25%胰酶将各孔细胞消化下来制成细胞悬液，以1×104/cm2的接种密度接种到24孔板，分为对照组(常规培养液)以及二个干预组(普伐他汀浓度分别为10 和100 μmol/L条件的培养液)，每组6孔，培养48 h后，进行eNOS表达和NO浓度的测定。

1.5eNOS表达和NO浓度的测定 按照RT-PCR试剂盒操作提取各组细胞RNA并进行RT-PCR(n=6)，按照一氧化氮测试盒要求检查各组各孔培养液中NO的浓度(n=6)。

1.6统计分析 所有结果以均数±标准差表示，输入SPSS13.0软件包，采用单因素方差分析比较各组均数，P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1EPCs鉴定 培养3 d洗去不贴壁细胞及碎片后，可见典型细胞集落：中间为大量的圆形细胞，层层叠叠，外周为纺锤形细胞，向外扩散(图1A)。培养第6天荧光显微镜检显示：细胞吞噬DiI-ac-LDL，显微镜下激发红色荧光(图1B)，空白对照及阴性对照均无荧光。Ⅷ因子相关抗原免疫组化阳性，胞浆呈棕色(图1C)，空白对照及阴性对照不显棕色。用流式细胞仪分析表明，表达CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin的细胞分别为(51.21±3.53)%、(19.15±3.45)%、(39.24±3.61)%及(54.28±3.56)%。

图1 EPCs的鉴定

2.2普伐他汀对EPC eNOS表达的影响 结果见图2，经半定量分析，与对照组相比，普伐他汀能明显提高EPCs eNOS表达(0.85±0.39 ，0.91±0.45 对0.50±0.31，n=6，P<0.05)；两不同浓度普伐他汀干预组之间无差别(P>0.05)。

2.3普伐他汀对NO合成的影响 与对照组相比，普伐他汀能明显增加EPC NO合成(60.76±7.26，71.25±11.26对47.70±6.13，P<0.05)；两不同浓度普伐他汀干预组之间无差别(P>0.05)。

3 讨论

图2 各组EPC eNOS RT-PCR电泳图

血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化以及缺血性疾病的早期表现之一。内皮功能障碍的一个重要特征是内皮源性的NO 合成、释放和活性受损。内皮型NO 减少通过促进血管收缩、血小板聚集、平滑肌细胞增殖和白细胞黏附而损伤血管内皮功能。EPCs 是一群能增殖分化为成熟血管内皮细胞但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，并参与出生后新生血管形成及内皮损伤修复的干/祖细胞。最近研究发现内皮损伤后的修复过程除了相邻成熟内皮细胞延展修复,还有一部分是通过外周血中的EPCs 分化为成熟内皮细胞来完成[2,3]，表明EPCs在维持正常血管内皮功能中扮演了重要角色。

近年来研究发现他汀类药拥有独立于降脂外的多项心血管保护作用，它能改善血管内皮功能，能促进内皮祖细胞动员增殖减少凋亡，并能增加其迁移黏附等活性[4～6]。此类作用的机制被认为跟他汀类药能上调内皮细胞eNOS的活性有关。它能通过多种细胞内信号传导途径影响eNOS的活性，如它通过调节RhoGTPase稳定细胞内eNOS水平，能通过蛋白激酶Akt途径增强eNOS活性来调节VEGF诱导的内皮细胞的迁移[7，8]。但过去此类研究多关注的是他汀类对成熟血管内皮细胞eNOS的活性以及NO合成和分泌的影响。有研究证明内皮祖细胞有与成熟内皮细胞相似的特性，表达eNOS能合成分泌NO[9]，而且内皮祖细胞的动员与内皮型NO的分泌密切相关[10]。故我们猜测他汀类药物同样对内皮祖细胞eNOS表达以及NO的合成和分泌有影响，内皮祖细胞作为血管内皮的前体细胞，他汀类对其功能的改善可能是其对整个血管内皮功能改善的重要组成部分。

在实验中，笔者观察到加入普伐他汀的内皮祖细胞eNOS表达增强，NO的合成分泌增加。这表明他汀类药物促进内皮祖细胞动员增殖和增强其迁移黏附等能力的机制可能部分是通过上调其eNOS的活性和NO的合成，其具体信号传导途径还需要进一步研究,有研究提示通过PI3K/Akt途径[11]。本实验提示了上调内皮祖细胞eNOS的活性和NO的合成是他汀类药物独立于降脂外的心血管保护作用之一，是他汀类药物治疗心血管疾病和其他缺血性疾病新的证据。鉴于内皮祖细胞特点及与新生血管的关系，本实验也同时表明增加eNOS表达、NO合成的药物可能可以用来有效治疗动脉粥样硬化以及缺血性疾病。

[1] Laufs U, La Fata V, Plutzky J,etal. Upregulation of endothelial nitric oxide synthase by HMG CoA reductase inhibitors[J]. Circulation, 1998, 97: 1129.

[2] Werner N, Junk S, Laufs U,etal. Intravenous transfusion of endothelial progenitor cells reduces neointima formation after vascular injury[J]. Circulation Research. 2003,93(2): e17.

[3] Griese DP, Ehsan A, Melo LG,etal. Isolation and transplantation of autologous circulating endothelial cells into denuded vessels and prosthetic grafts: implications for cell-based vascular therapy[J]. Circulation，2003,108(21): 2710.

[4] Mariuca V，Stephan F，Klaudia A，etal. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease[J]. Circulation, 2001,103:2885.

[5] Ramunni A， Brescia P， Dambra P，etal. Effect of low-density lipoprotein apheresis on circulating endothelial progenitor cells in familial hypercholesterolemia[J]. Blood Purif，2010， 29(4): 383.

[6] Bao XM, Wu CF, Lu GP .Atorvastatin inhibits homocysteine-induced dysfunction and apoptosis in endothelial progenitor cells[J].Acta Pharmacol Sin，2010 ，31(4): 476.

[7] Dimmeler S, Fisslthaler B, Fleming I,etal. Activation of nitric oxide synthase in endothelial cells via Akt-dependent phosphorylation[J]. Nature，1999，399:601.

[8] Fulton D, Gratton JP, McCabe TJ,etal. Regulation of endotheliumderived nitric oxide production by the protein kinase Akt[J]. Nature，1999，399:597.

[9] Shirota T, He H, Yasui H,etal. Human endothelial progenitor cell-seeded hybrid graft: proliferative and antithrombogenic potentials in vitro and fabrication processing[J]. Tissue Eng,2003, 9(1): 127.

[10] Ulf L，Niels E，Ferdinand HB，etal. Statin-induced improvement of endothelial progenitor cell mobilization, myocardial neovascularization, left ventricular function, and survival after experimental myocardial infarction requires endothelial nitric oxide synthase[J]. Circulation，2004，110(14): 1933.

[11] Sugawara T, Ayer R, Jadhav V,etal. Simvastatin attenuation of cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in rats via increased phosphorylation of Akt and endothelial nitric oxide synthase[J]. J Neurosci Res，2008，86(16):3635.

2010-08-01

[修回日期] 2010-12-12

Effectsofpravastatinonnitricoxideproductioninendothelialprogenitorcells

XIAO Gang-feng1, ZHANG Huai-qin2

(1. The Second Hospital of Ningbo , Ningbo 315000,China; 2. The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of pravastatin on nitric oxide production in endothelial progenitor cells.MethodsTotal mononuclear cells(MNCs) were isolated from peripheral blood by Ficoll density gradient centrifugation,and cultured in vitro. After 7 days of culture, attached cells were stimulated with pravastatin (10 and 100 μmol/L) for 48 h. The cells were identified by immuno-histochemistry and flow cytometry and tested the ability to intake the acLDL. The content of NO and the level of endothelial nitric oxide synthase ( eNOS) mRNA were tested.ResultsCompared with control group, the content of NO and the level of eNOS of pravastatin group increased obviously (P<0. 05).ConclusionsPravastatin could increase the production of nitric oxide and the expression of eNOS mRNA in EPCs, which could improve blood vessel endothelium function.

pravastatin; endothelial progenitor cells; nitric oxide; endothelial nitric oxide synthesis

肖刚峰(1981-)，男，硕士，主治医师.Tel：13867855268，E-mail:ducan11@163.com.

R972;R96

A

1006-0111(2011)02-0111-03