微透析与液相色谱-质谱联用在药物分析中的应用

吕狄亚, 洪战英, 娄子洋, 曹 岩, 董 昕, 柴逸峰

(第二军医大学药学院,上海 200433)

微透析与液相色谱-质谱联用在药物分析中的应用

吕狄亚, 洪战英, 娄子洋, 曹 岩, 董 昕, 柴逸峰

(第二军医大学药学院,上海 200433)

目的综述微透析与液相色谱-质谱联用技术在药物体内化学成分分析中的研究进展。方法参阅近几年国内外相关文献，对微透析与液相色谱-质谱联用技术在药物体内内源性物质及外源性物质中的应用进行归纳与总结。结果与结论微透析与液相色谱-质谱联用作为一种新型的分析技术，具有快速简便、干扰少、前处理简单等优点。此项技术在体内药物分析中得到了迅速推广和应用，特别在药代动力学研究中显示出其独特的优势，具有十分广阔的应用前景。

微透析；液相色谱-质谱

微透析是一种用于监测动物和人类细胞外液、组织、大脑活性物质的生理水平的活体取样技术。最初应用于研究脑脊髓液化学环境[1]，目前已广泛应用于诸如药物透皮给药研究[2]、组织药代动力学研究[3]、组织药物的局部代谢研究等领域[4，5]。

将微透析与多种分析技术联用，微透析不仅可与分离技术如高效液相色谱(HPLC)[6]、毛细管电泳(CE)[7]等联用，还能与检测系统如质谱测定(MS)、放射免疫测定(RIA)、电化学检测(ECD)、荧光检测等联用。但与其他联用技术相比，液相色谱-质谱联用( liquid chromatography-Mass Spectrometry， LC-MS)技术是目前普遍适用于与微透析结合进行分离、分析的技术。近年来，LC-MS在药学、生物学、临床医学等领域也得到了广泛的应用。因此，本文综述了近十年LC-MS在检测透析液中的内源性物质(乙酰胆碱、生物胺、氨基酸及其他神经递质和神经肽类物质)和外源性物质(药物)中的应用。

1 微透析

1.1微透析原理 微透析技术(microdialysis)是在非平衡条件(即流出的透析液中待测化合物的浓度低于它在探针膜周围样品基质中浓度)下，灌注植入组织中的微透析探针，组织中待测化合物沿浓度梯度逆向扩散进入透析液，被连续不断地带出，从而达到从活体组织中取样的目的[8]。

微透析取样装置主要由微量泵、微透析探头、收集器、连接管及配套设备组成。微量泵以注射泵为佳，有利于减少恒流泵和蠕动泵的波动，流速一般为1～5 μl/min。在微透析系统中，探针是最关键的部分。

1.2微透析探针 微透析探针可以植入生物体的各个组织器官，包括肝脏[9，10]、心脏[11，12]、皮肤[5]、血液[13，14]、胎盘[15]、胃[16，17]和耳朵[18]等。探针的作用就像血管一样，运送物质到特异部位或从特异部位将其移除，而不会有液体流失。微透析探头通常是由一管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成双层管道；长度一般为1～10 cm。半透膜由再生纤维素、聚碳酸酯或聚丙烯腈制成,载留分子量5～10 kD不等。实际应用需根据具体组织和待测物选择不同的微透析探头。探针的主要类型分为同心圆探针、线性探针、柔性探针、分流探针。最常用的是同心圆探针(如图1-A),主要用于神经化学物质的研究，这种类型的探针可以通过一个导管伸入大脑特定的区域，从而检测神经递质的释放。另外，线性探针(如图1-C)主要应用于软组织，包括肝脏、肌肉、心脏和皮肤，故探针的表面积通常比用于脑的探针大一些。此类型的探针可把活性膜部分充分包埋在靶组织中，如肿瘤部位的取样。柔性探针(如图1-B)主要用于血液的取样。这类探针是由Telting-Dia等[19]设计的，用于清醒动物的血液取样时，由于此探针可弯曲，即使动物动弹也不会伤到其血管。分流探针(如图1-D)主要用于清醒动物的胆汁取样。此外，分流探针还可将蛋白样品脱盐后注入质谱进行分析。为了使大分子样品分析成为可能，同时增加小分子样品的回收率，发展了一种低流速、推拉灌注的探针。这种探针由充满盐的27-G不锈钢套管组成。使用这种类型的探针，流速可达50 nl/min，回收率为100%[20]。

图1[21] 四种探针的类型

由于微透析探针体积小，对动物本身不构成伤害，使多种类型探针在同一动物身上测定血浆、脑、组织中药物或内源性物质的浓度成为可能。Huff等[22]使用同心圆探针和柔性探针，通过静脉给药，运用液相-电子电离源(LC-EI)检测脑部和血浆中的药物。但是，探针植入时间过长，会导致组织损伤，同时，纤维化或神经胶质增生也会在探针植入后数日出现。虽然细胞外水肿会增大探针和细胞外液的扩散面积，但这个类似纤维化的聚合物会增大细胞周围透析探针和细胞外液环境之间的物理屏障[23]。这些因素都会影响探针的回收率。因此，在基于局部脑血流(LCBF)和局部脑葡萄糖代谢(LCGM)的分离试验中，Benveniste等人提出探针植入后，回收的周期为24 h[24]，以避免上述因素的影响。

2 微透析与LC-MS联用技术

微透析与LC-MS联用技术包括离线、在线联用。离线联用技术主要用于解决样品处理过程中提取或是透析液繁琐的处理步骤[25]。然而，这样的处理步骤有时会将样品污染。相比于离线技术，在线联用技术具有许多优点，如简单的样品处理过程、自动化分析、结果自动反馈、减少了样品流失以及处理过程中的污染物[25～27]。总之，无论是离线技术或是在线监测技术，都需要匹配一个合适的监测器。乙酰胆碱(ACh)在外周和中枢神经系统中起到重要的作用，因此许多传统的离线分析方法如气相、质谱、放射酶促分析法等都用于乙酰胆碱的测定。然而，这些方法的不足在于样品预处理繁琐，监测器灵敏度低。近年来，Hows等[28]将微透析与LC-MS/MS实现在线联用,可以获得对乙酰胆碱灵敏度更好的测定结果。

3 微透析与LC-MS联用在内源性物质分析中的应用

20世纪60年代，微透析技术首次用于动物脑中的氨基酸和其他电解质研究的实验中[29]。由于收集到的细胞外神经性物质十分有限(<40 μl)，低灵敏度、低选择性、样品处理耗时的GC-MS[30]很难对其进行分析和检测。尽管液相色谱中常用的检测器种类有很多，如荧光检测器、紫外检测器(UV)、质谱检测器(MS)，但只有质谱检测器具有直接、高灵敏度和高选择性的优点，同时，还可以通过保留时间和分子质量对分析物进行确定。赵先恩等[31]采用BCEOC作为柱前衍生试剂，LC-MS联用技术实现了2种氨基酸类和3种单胺类神经递质的同时完全衍生与检测。

近年来，微透析已经用于游离的内源性物质的检测中，如儿茶酚胺、5-羟色胺、氨基酸类等物质的研究中。Chengjie等[32]采用UPLC-MS/MS同时测定大鼠前额皮质中一组单胺类神经递质，包括去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)以及异丙肾上腺素(ISO)，结果显示灵敏度良好。Zhang等[33]采用LC-MS/MS同时检测大鼠脑透析液中的乙酰胆碱、胆碱和异乙酰胆碱。经过优化的高灵敏度质谱条件使检测基底胆碱成为可能。

4 微透析与LC-MS联用在外源性物质分析中的应用

随着高灵敏度和高选择性的MS/MS问世，逐步替代了紫外检测器和荧光检测器。微透析与LC-MS联用已广泛应用于化合、中药、重金属等物质的研究中。对于这些外源性物质的机制研究发挥了很大的作用。

4.1微透析与LC-MS联用在化学药物分析中的应用 化学药物包括精神类药物、抗生素、抗癌药物、化合物等等。Lovenberg, Timothy等[34]应用微透析结合LC-MS/MS技术对诺氟西汀进行大鼠药动和药效研究。结果显示，诺氟西汀有助于5-HT的转运抑制作用。Guo,Ping等[35]采用微透析与LC-MS/MS联用技术分析抗癌药物甲氨蝶呤及其代谢产物7-羟基甲氨蝶呤在小鼠血浆及脑组织中的药动学参数。该方法需要样品量少，迅速，同时测定小鼠血浆及脑组织中的甲氨蝶呤及7-羟基甲氨蝶呤，得到了详细的药动学数据。

4.2微透析与LC-MS联用在单味中药分析中的应用 中药的化学成分是其发挥药效作用的物质基础，但是中药化学成分复杂、有效成分不确定、含量低、难以检测、类似物多样等局限了中药的研究。

LC-MS 既能同时分析一个样品中的药物及多种代谢物,也能分析单一动物给药后同一样品中的多个化合物,也可把含有不同化合物的样品合并分析,可实现体内和体外代谢研究的高通量分析。苦参素(OMT)和苦参碱(MT)是槐属和苦参根中主要的喹啉联啶生物碱[36]。临床上主要用于治疗病毒性肝炎、癌症、心脏病和皮肤病(如银屑病和湿疹)[36,37]。对苦参素(OMT)和苦参碱(MT)进行分析的方法较多，例如，高效毛细管色谱法(HPCE)[38]、高效液相色谱法(HPLC)等等[39,40]。但当这些方法的UV检测在218 nm时，由于药物本身在血浆中的浓度较低，并且可能存在内源性物质的干扰，因此，在血浆中对其进行定量十分困难。 Zheng等[41]采用微透析取样，运用高通量液相色谱/串联质谱(high-throughput LC-MS/MS)测定大鼠血液和表皮微透析液中苦参素及其代谢产物苦参碱。随着微透析与LC/MS联用技术的不断发展,这一技术将会成为高通量快速筛选寻找先导化合物即新药发现的首选工具之一。

4.3微透析与LC-MS联用在中药复方分析中的应用 中药通常经配伍后服用，中药复方制剂在药效上可以发挥协同作用亦或拮抗作用[42]。因此，建立一个灵敏度高、选择性好同时测定中药活性成分的方法非常必要。现在，常采用筛选和分析生物活性物质中的复杂成分来研究中药与生物系统(如DNA、蛋白、细胞等)的相互作用的特征[43,44]。有研究者采用活体细胞萃取与LC-MS[45]结合来筛选中药复方配伍中潜在的活性物质。鉴于微透析技术特有的优势， Wen等[46]采用微透析与HPLC-DAD-MS联用分析复方，当归补血汤(CPDBD)中的生物活性物质与蛋白相互作用。通过与化学对照品比较tR、MS值、UV谱，研究者从CPDBD中鉴定出九种化合物并对其定量分析。微透析-HPLC-DAD-MS成功应用于中药与蛋白相互作用的研究。

为了对生物样品中的有效成分进行定量分析，发展了许多HPLC-MS/MS的方法，然而，这些方法都有其局限性，如低灵敏度、保留时间长、产率低等。超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC) 能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，是一种采用小颗粒填料色谱柱(粒径小于2 μm)和超高压系统(压力大于105 kPa)的新型液相色谱技术，因此特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究[47]。Huang等[14]将最新的取样技术-微透析技术与先进的分析方法，超高效液相色谱-串联质谱联用，同时测定大鼠脑和血浆中游离的黄芩苷。此方法的优点在于快速定量。UPLC联用技术结合微透析技术在中药复杂体系分离中发挥了巨大的优势，为今后进一步研究黄芩苷的药代动力学奠定了基础，可见此项技术具有卓越的分离性能和高通量的检测水平，能够充分适应药物代谢动力学的新发展，成为推动其进步的动力之一。

5 结语

微透析与LC-MS联用已广泛应用于药物代谢和神经生化分析等研究中。目前微透析与LC-MS联用作为连续监测和鉴定待测物已经被越来越普遍地使用。尽管微透析有许多优点，如活体取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等。对药物代谢动力学的研究多采用测定血、尿、粪便、组织匀浆液中药物及其代谢产物的浓度，而微透析的优势在于时间节点的可选择性，避免了传统药物研究中处死动物，同时可以对同一动物收集大量的样本进行分析。但也有其不足之处，如探针回收率的好坏一直是微透析技术面临的首要问题。笔者认为微透析与LC-MS联用技术，不仅可用于中药活性成分的测定，也可用于化学药物、生物制品分析，尤其在药物代谢动力学研究中具有独特优势。

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2010-09-26

[修回日期] 2010-12-30

Applicationofmicro-dialysis-LC/MSinpharmaceuticalanalysis

LV Di-ya, HONG Zhan-ying, LOU Zi-yang, CAO Yan, DONG Xing, CHAI Yi-feng

(School of Pharmacy, Second Military Medical University ,Shanghai 200433, China)

ObjectiveTo review the micro-dialysis coupled with chromatographic technologies in pharmaceutical analysisinvivo.MethodsThe relevant literatures were collected to make a summary of microdialysis coupled with chromatography technology in pharmaceutical analysisinvivo.ResultsandConclusionsAs a new sampling technology, microdialysis coupled with LC-MS had advantages of high sensitive, fast, simple, less interference, and no sample preparation. This technology had been rapidly promoted and applied, especially in the pharmacokinetic-pharmacodynamic studies which had broad application prospects.

microdialysis; LC-MS

国家自然科学基金资助委员会资助项目(30873196)；上海市科学技术委员会科研计划项目(09dZ1975100).

吕狄亚(1984-)，女，硕士研究生. Tel: (021)81871337,E-mail:diyalv2008@yahoo.com.cn.

柴逸峰 . Tel: (021)81871201,E-mail:yfchai@smmu.edu.cn.

R917

A

1006-0111(2011)02-0093-05