正交试验优选镰形棘豆总黄酮活性炭脱色工艺

杜青云，洪佳妮，李茂星,陈锦珊

(1.厦门大学医学院药学系，福建 厦门 361005； 2.解放军第175医院药剂科，福建 漳州 363000； 3.兰州军区兰州总医院药材科，甘肃 兰州 730050)

正交试验优选镰形棘豆总黄酮活性炭脱色工艺

杜青云1，2，洪佳妮1，2，李茂星3,陈锦珊2

(1.厦门大学医学院药学系，福建 厦门 361005； 2.解放军第175医院药剂科，福建 漳州 363000； 3.兰州军区兰州总医院药材科，甘肃 兰州 730050)

目的优选镰形棘豆总黄酮活性炭脱色工艺。方法以温度、时间和活性炭用量为考察因素，脱色液颜色、260～420 nm紫外吸收情况和总黄酮含量为考察指标，采用正交试验法探究最佳脱色条件。结果脱色最佳工艺为在40 ℃下，加入1 %活性炭，搅拌5 min。结论该脱色工艺可行，既能达到脱色效果，又能保留有效成分。

镰形棘豆；总黄酮；脱色工艺；正交试验

镰形棘豆在藏药中称为草药之王，多年生草本，具有清热解毒、生肌愈疮、涩脉止血、通利大便等功效[1]。它主要产于我国西藏、青海、甘肃南部、四川西部，是一种丰富的藏药资源，现代研究表明黄酮类化合物是其主要化学成分[5]，在波长260～420 nm具有明显的吸收。从该植物提取精制具有紫外线吸收功能的总黄酮成分，可进一步制成天然防晒护肤品[3]。然而利用总黄酮提取物制得的霜剂常呈黄褐近黑色，不利于该防晒品的开发。活性炭是一种良好的吸附剂，具有吸附量大、再生速度快、污染小等优点[4]。本文以总黄酮提取物为原料，粉末活性炭为脱色剂，研究影响镰形棘豆总黄酮提取液的脱色因素，探讨最佳脱色条件。

1 仪器与材料

1.1仪器 分析天平(METTLER TOLEDO仪器有限公司)，旋转蒸发仪(厦门精艺兴业科技有限公司，N-1001D-WA)，磁力加热搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)，pH计(常州远宇干燥设备有限公司)，紫外-可见分光光度计(天美科技有限公司，U2810)。

1.2材料 镰形棘豆(购自甘肃省曲玛县黄河源药材公司，经兰州大学药学院赵汝能教授鉴定为豆科棘豆属植物镰形棘豆OxytropisfalcataBunge全草)；芦丁对照品(中国药品生物制品检验所，200707)；二氯氧锆(ZrOCl2，国药集团化学有限公司，F20090814)；活性炭(广东汕头市西陇化工厂有限公司，20090917)；无水三氯化铝(上海宏瑞化工有限公司，20081220)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，20091021)，无水甲醇(国药集团化学试剂有限公司，20090416)。

2 方法与结果

2.1镰形棘豆总黄酮的提取与精制 称取药材200 g，粉碎，加10倍量95%乙醇浸泡3 d，重复浸泡3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩至较少体积，用石油醚脱脂，大孔树脂富集纯化[5]，浓缩至浸膏，真空干燥得提取物。

2.2总黄酮含量测定[6,7]

2.2.1标准曲线绘制 参照文献采用二氯氧锆比色法进行测定，得453 nm 下对照品溶液各浓度的吸光度。以吸光度(y)对芦丁浓度(x)作标准曲线，得回归方程为:y=0.048 4x+0.015 5，r=0.999 8。

2.2.2样品测定 精密称取镰形棘豆提取物0.01 g 3份，分别用无水乙醇溶解至10 ml容量瓶，得供试品溶液。同样参照文献方法进行水解显色，测定453 nm的吸光度值，根据回归方程求出供试液中总黄酮浓度，计算提取物的总黄酮含量，取平均值，得含量为19.50%。

2.3单因素考察 选取脱色温度、脱色时间、活性炭用量3个影响因素，分别做单因素试验。具体操作如下：取25 ml烧杯，分别加入10.0 ml提取液(提取物0.01 g，加10 ml无水乙醇溶解，呈深黄褐色，经pH计测定，其pH值为5.0)，按设计要求，加入适量的活性炭，置于磁力加热搅拌器，在设定的温度下搅拌脱色至相应的时间。脱色后趁热过滤，收集滤液，取各滤液1 ml，至10 ml容量瓶，加入1 ml 4%三氯化铝溶液，用50%乙醇定容。以随行试剂为空白，在紫外分光光度计下测定260～420 nm的吸光度。

2.3.1温度对脱色效果的影响 设置30、40、50、60、70 ℃五个脱色处理温度，按1.0%的活性炭用量，置于磁力加热搅拌器搅拌10 min。比较滤液颜色，得颜色由深至浅依次为：30 ℃(浅黄微褐色)、40 ℃(浅黄色)、50 ℃(微黄色)、60 ℃(近无色)、70 ℃(无色)。测定紫外吸收值，结果见图1。由图可知，70 ℃和60 ℃下的紫外吸收较好，其次为40 ℃，但试验中温度越高，得到的脱色滤液量越少，故综合考虑，脱色温度以40 ℃左右为宜。

图1 不同温度下镰形棘豆提取液脱色所得滤液的紫外吸收曲线

2.3.2时间对脱色效果的影响 设置5、10、15、20 min 4个脱色时间，按1.0%的活性炭用量，分别搅拌5、10、15、20 min。比较滤液颜色，得颜色由深至浅依次为：5 min(浅黄褐色)、10 min(浅黄色)、15 min(淡黄色)、20 min(近无色)。测定紫外吸收值，结果见图2。由图可知，随着脱色时间增加，脱色滤液的紫外吸收值越小，所得滤液量也越少。故综合考虑，脱色时间以10 min左右为宜。

图2 镰形棘豆提取液不同脱色时间所得滤液的紫外吸收曲线

2.3.3活性炭用量对脱色效果的影响 设置0.5%、1%、1.5%、2%4个活性炭用量，在40 ℃下分别脱色10 min。比较滤液颜色，得颜色由深至浅依次为：0.5%(浅黄褐色)、1%(微黄褐色)、1.5%(近无色)、2%(无色)。测定紫外吸收值，结果见图3。由图可知，随着活性炭用量增加，脱色滤液的紫外吸收值越小，所得滤液量也越少。故综合考虑，活性炭用量以1%左右为宜。

图3 镰形棘豆提取液不同活性炭用量所得滤液的紫外吸收曲线

2.4正交试验

2.4.1因素水平选择 影响活性炭脱色的因素较多，根据单因素实验结果，选取三因素三水平进行正交试验。因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平

2.4.2正交试验结果与分析 取20.0 ml总黄酮提取液，按正交试验方案进行脱色。收集各脱色滤液，比较颜色。取1 ml滤液同前于紫外分光光度计上测260～420 nm的吸收值，见图4，10为提取液脱色前的紫外吸收情况。另取1 ml滤液，参照文献方法进行水解显色[6]，测定453 nm的吸光度值，计算各条件下所得脱色液总黄酮含量。

2.4.3数据处理 以滤液颜色、260～420 nm紫外吸收情况、总黄酮含量三项作为衡量脱色效率的考察指标，采用加权评分法。设定滤液颜色无色为100分，图4中10号即脱色前提取液的紫外吸收为100分，对二者进行量化评分。将各项指标除以该列最大值再乘以100，为该项得分。根据三项指标权衡，确定三者的权重系数为0.4、0.3、0.3，对三项指标进行加权求和，得到综合评分，分值越大说明该脱色条件脱色效果越好，有效成分保留越多。正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

图4 正交试验各脱色滤液的紫外吸收曲线

NO因素水平ABC颜色深浅分值吸收度分值总黄酮含量%综合评价总分11111浅黄褐色358516.4376.3321222微黄褐色65257.1449.9231333微黄近无色80100.1037.4142123微黄淡褐色705511.9671.8952231近无色90203.2051.1162312浅黄淡褐色556013.3369.9773132微黄微褐色75203.8245.9883213浅黄浅褐色457515.8075.8093321近无色90121.3444.71K1163.66194.20222.10172.15K2192.97176.83166.52165.87K3166.49152.09134.50185.10Rj29.3142.1187.6019.23

表3 方差分析表

注：F0.05(2，2)= 19.00，“*”表示有显著性影响。

由表2、表3可知，活性炭脱色的影响因素大小顺序为:C>B>A，即活性炭用量影响最大，脱色时间影响次之，脱色温度影响最小，其中活性炭用量对脱色效果有显著性影响。考虑脱色滤液量随时间、温度增加而减少，并结合脱色滤液颜色 ，确定最佳脱色工艺为A2B1C2，即在40 ℃下，加入1%活性炭，搅拌5 min。

2.5验证试验 精密称取镰形棘豆提取物0.01 g 3份，分别用无水乙醇溶解至10 ml容量瓶。将3份10 ml样液按最佳脱色工艺进行试验。收集脱色滤液，颜色为浅黄微褐色，同前测定260～420 nm紫外吸收度，并测定总黄酮含量分别为12.29%、11.47%、11.88%、。结果表明，该最佳脱色条件可行。

3 讨论

3.1本研究中的镰形棘豆总黄酮提取物为醇提物，并经过进一步纯化而得。经测定，提取物中的总黄酮含量为19.50%，较水提物提高许多[6]。提取液颜色为深褐近黑色，经活性炭脱色后，颜色明显改善，有利于防晒产品的进一步开发。优化的脱色工艺既能达到脱色效果，又能保留有效成分。

3.2测定紫外吸收度是评价防晒产品防晒性能的方法之一[8，9]。本研究的总黄酮成分在中波有较强的吸收，在长波也有一定的吸收，测定260～420 nm的吸光度不仅能考察总黄酮的含量情况，还可进一步说明防晒效果。

3.3研究中使用的活性炭为黑色细微粉末，无臭、无味，具有无毒、脱色效果好的特点，可以反复使用，成本低。脱色液虽经抽滤，但仍有少量活性炭残渣难于除去，故应进一步选用合适的活性炭粒度，以利于脱色后进行过滤。

[1] 姜 华,胡君茹,刘 霞.镰形棘豆的研究进展[J].中草药,2006,37(2):413.

[2] 刘 斌.中国棘豆属药用植物及其现代研究[J].中国野生植物资源,1997,16(2):15.

[3] 杜青云,洪佳妮,郭云勇,等.镰形棘豆防晒霜的研制与质量评价[J].医药导报,2010,29(2):229.

[4] 杨 娜,杨栋梁,刘佳佳,等.颗粒活性炭脱色对发酵大蒜水提液中活性成分的影响[J].食品工业科技,2007,28(5):751.

[5] 刘延彤,李茂星,杜青云,等.大孔吸附树脂富集藏药镰形棘豆总黄酮的工艺研究[J]. 药学实践杂志,2008,26(6):438.

[6] 李茂星,贾正平,杜青云,等.二氯氧锆比色法测定镰形棘豆水提取物中的总黄酮[J].华西药学杂志,2008,23(4):466.

[7] 张汉明,李茂星.胃怡胶囊中总黄酮的含量测定[J].药学实践杂志,1995,13(3):178.

[8] 杜小豪,徐 卫.防晒化妆品防晒效果评价方法——紫外吸光度法的研究[J].日用化学工业,1998,6(3):43.

[9] Marginecan G.New ex-vivo method for evaluating the photoprotective efficacy of sunscreens[J].International Journal of Cosmetic Science,1995,17:233.

2010-03-26

[修回日期] 2010-08-06

OptimizationofdecolorizationtechnologyoftheOxytropisfalcatatotalflavoneswithactivecarbonbyorthogonalexperiment

DU Qing-yun1,2, HONG Jia-ni1，2,LI Mao-xing3,CHEN Jin-shan2

(1.Department of Pharmacy, Medical College of Xiamen University, Xiamen 361005，China; 2.Department of Pharmacy, the 175th Hospital of PLA, Zhangzhou 363000，China; 3.Department of Pharmacy, Lanzhou General Hospital of PLA, Lanzhou 730050，China)

ObjectiveTo optimize the decolorization technology ofOxytropisfalcatatotal flavones with active carbon.MethondsTemperature, stirring time and the content of active carbon were used as the orthogonal experiment factors. The colour of filtrate, the ultraviolet absorption between 260 nm to 420 nm and the content of total flavones were set as the indexes to investigate the optimal decolorization technology.ResultsThe optimal decolorization technology was achieved under the condition as 40 ℃, stirring 5 min with 1% active carbon.ConclusionThe decolorization technology is feasible which had good decolorization result and could hold effective ingredient.

Oxytropisfalcata; total flavones; decolorization technology; orthogonal experiment

全军医药卫生“十一五”课题面上项目(06MB95)；南京军区医药卫生科研课题 (06MA-95)．

杜青云(1953-)，女，主任药师，教授,硕士生导师.E-mail:175dqyun@163.com.

陈锦珊.Tel:(0596)2925193,E-mail:cjs1223@sohu.com.

R283

A

1006-0111(2011)02-0105-04