大孔吸附树脂对鱼籽多肽脱色工艺

徐秉歆，王晗 ，裴栋 ，邸多隆 ，王利涛*，魏鉴腾 , *

1.济宁医学院药学院（日照 276826）；2.中国科学院兰州化学物理研究所中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室（兰州 730000）；3.青岛市资源化学与新材料研究中心（青岛 266100）；4.烟台中科先进材料与绿色化工产业技术研究院（烟台 264001）

海洋生物活性肽是来源于海洋且具有生物学活性的一类化合物的总称，其具有抗炎症[1]、抑菌、抗肿瘤[2-3]、抗高血压[4]、抗衰老[5]等生理功能，在食品、药品等领域应用广泛[6]。鱼籽是水产加工副产品，前期研究发现，鱼籽多肽有抗氧化、降血糖等生理活性[7]。其加工过程中残留有棕褐色色素，严重影响进一步开发，因此，对鱼籽多肽脱色工艺的探究有重要意义[8]。

大孔吸附树脂是一类有较好吸附性能的有机高聚物吸附剂，其具有成本低、稳定性高、吸附速度快、可重复使用等[9]优点。试验以鱼籽多肽为研究对象，其脱色率和得率为评价指标，得到优选大孔吸附树脂，并通过单因素试验和响应面试验[10]，筛选出最佳脱色工艺条件，为鱼籽多肽进一步研究与开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼籽（山东省青岛市南山市场）；康宁Corning 3599 96孔板（美国康宁公司）；盐酸、氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）；95%（V/V）乙醇消毒液（山东省利尔康医疗科技股份有限公司）；Na+732阳离子树脂、氯717阴离子树脂、HPD450、LSCAS、MCI、LSA-21、LSA-40、DM-130、LX69B、YWD12G、HPD100、LX68M、LSA-50型树脂[南京贝斯特生物技术有限公司、西安蓝晓科技新材料股份有限公司、麦科仪（北京）科技有限公司、上海紫一试剂厂、安徽三星树脂科技有限公司]；等。

1.2 仪器与设备

HWS26型电热恒温水浴锅、DHG-940A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Sartorius BSA224S电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）]；WD-2102A型酶标仪（北京六一仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 大孔吸附树脂预处理

分别将13种树脂用乙醇浸泡并洗涤，至流出液加水无浑浊，再用去离子水洗至无乙醇味，待用[11]。

1.3.2 鱼籽多肽脱色率、得率测定

脱色前后多肽上清液，在630 nm波长处测定吸光度，烘干、称重，按式（1）和（2）计算脱色率、得率[12]。

式中：A1为脱色前样品吸光度；A2为脱色后样品吸光度。

式中：M1为脱色前样品质量；M2为脱色后样品质量。

1.3.3 脱色大孔吸附树脂种类的筛选

选取预处理后的树脂对鱼籽多肽进行脱色处理，分别检测脱色率和得率，筛选出最佳大孔吸附树脂。

1.3.4 鱼籽多肽脱色的单因素试验

分别考察脱色剂用量（2，3，4，5和6 g/g）、脱色温度（20，30，40，50和60 ℃）、脱色时间（1，2，4，6和8 h）以及pH（pH 3，5，7，9和13）对鱼籽多肽脱色率和得率的影响。

1.3.5 响应面试验

在单因素试验基础上，依据Box-Behnken试验设计原理，以鱼籽多肽脱色率和得率为响应值，设计四因素三水平的响应面试验[13]，见表1。将所得数据用Design-Expert 8.0.6软件进行二次多项式拟合及分析。

表1 响应面因素与水平设计表

2 结果与讨论

2.1 不同大孔吸附树脂对鱼籽多肽脱色工艺的影响

由图1可知，在脱色剂用量2 g/g、脱色温度20 ℃、脱色时间8 h、pH 5条件下，综合考虑脱色率与得率，选择大孔吸附树脂LSA-50进行脱色工艺优化。

图1 不同大孔吸附树脂对鱼籽多肽脱色工艺的影响

2.2 鱼籽多肽脱色工艺单因素试验结果

由图2（a）可知，树脂用量对脱色工艺有显著影响，随着树脂用量增加，多肽脱色率先迅速增长后逐渐放缓。得率下降，可能是由于树脂用量增加，比表面积增大，对多肽吸附能力增大。故用量最佳为4 g/g。由图2（b）可知，温度与脱色率变化呈正相关。但温度升高，得率先升后降。可能是：温度低时，温度升高，多肽解吸附加快，得率上升；温度高时，树脂溶胀系数增加，孔径变大，多肽进入，得率下降。故优选40 ℃。由图2（c）可知，脱色率随时间延长而增大，2 h后多肽得率开始下降，因此，最优时间选2 h。由图2（d）可知，多肽脱色率随pH升高而增大，酸性条件下脱色效果好。得率随pH升高，先下降后上升。结合实际生产多肽料液pH，最佳pH 5。

图2 各单因素对鱼籽多肽脱色工艺的影响

2.3 响应面法优化分析

2.3.1 响应面试验结果

将表2结果进行拟合得回归方程：脱色率Y1=79.86+3.42A+4.85B+0.82C+3.38D-1.00AB-0.81AC-0.24AD+0.020BC-0.54BD+0.46CD-0.85A2-1.48B2+0.48C2-1.65D2；得率Y2=60.75-5.23A-0.028B+1.99C-8.36D+0.62AB+1.87AC-0.36AD-0.31BC-1.43BD-4.70CD-1.41A2-1.25B2+0.90C2+2.26D2。

2.3.2 响应面方差分析结果

对表2进行显著性检验及方差分析，结果见表3。Radj2为95.16%和87.96%，表明拟合值与实际值相关性好。模型p值小于0.01，有极显著差异；失拟项p值大于0.05，无显著差异；变异系数（C.V.）分别为1.33%和4.15%，说明该模型相关性较好，模型构建合理。

表2 响应面试验设计结果

对表3分析可知，对鱼籽多肽脱色率有显著影响（p＜0.05）的因素有A、B、C、D、B2、D2，其中各单因素对其脱色效果影响的大小顺序为脱色时间（B）＞树脂用量（A）＞pH（D）＞脱色温度（C）。对鱼籽多肽得率有显著影响（p＜0.05）的因素有A、C、D、CD、D2，其中各单因素对得率影响的大小顺序为pH（D）＞树脂用量（A）＞脱色温度（C）＞脱色时间（B）。

表3 响应面方差分析结果

2.3.3 双因素的交互影响

由图3（a）可知：脱色温度和pH选最优值，树脂用量一定，脱色时间延长，脱色率显著升高；脱色时间一定，脱色率随树脂用量增加而增大。由图3（b）可知：脱色温度和时间选最优值，树脂用量一定，脱色率随pH升高而增大；pH一定，脱色率随树脂用量增大缓慢升高。由图3（c）可知：树脂用量和脱色温度均选最优值，脱色时间一定，脱色率随pH增加先增加后趋于平缓；pH一定，脱色时间增长，脱色率增大。

图3 脱色率的双因素交互影响

由图4（a）可知：脱色温度和pH选最优值，树脂用量一定，脱色时间延长，得率先升高后降低；脱色时间一定，得率随树脂用量增加急速上升。由图4（b）可知：树脂用量和脱色时间选最优值，脱色温度一定，得率随pH增大而上升；pH一定，得率随温度升高先升高后降低。

图4 得率的双因素交互影响

2.3.4 鱼籽多肽最佳脱色工艺条件验证

综上所述，大孔吸附树脂LSA-50对鱼籽多肽脱色最优工艺条件：树脂用量4.94 g/g，脱色时间2 h，脱色温度55 ℃，pH 4。在此条件下，多肽理论脱色率为80.07%，理论得率为77.98%。验证结果显示，脱色率为80.20%，得率为77.05%。由此可见，脱色率和得率的预测值与理论值相近，说明构建的模型合理，脱色工艺可行。

3 结论

以鱼籽多肽为研究对象，最优脱色大孔吸附树脂LSA-50对应的最佳脱色工艺条件：树脂用量4.94 g/g，脱色时间2 h，脱色温度55 ℃，pH 4。在此条件下，脱色率为80.20%，得率为77.05%。该工艺对鱼籽多肽脱色效果较好，为鱼籽多肽进一步研究、开发提供技术支持。