响应面法优化藜麦蛋白提取工艺

冯玉兰，罗威，孙家美，马关浩，石书骏，魏玉梅*

西北民族大学（兰州 730030）

藜麦（Chenopodium quinoaWilld）是藜科藜属植物，原产于南美洲的安第斯山区和玻利维亚地区[1]。藜麦蛋白的氨基酸含量达15%[2-3]，且其氨基酸比例接近联合国粮农组织推荐的理想蛋白比例，藜麦蛋白的生物学价值和牛奶相当[4-5]，具有抗氧化[6]、降低胆固醇、抗癌症[7]等生物活性。藜麦蛋白还具有易于吸收，不易过敏[8]的优点，因此藜麦可作为一种优质的植物蛋白来源[9]。关于藜麦蛋白分离提取的方法，常用的有碱溶酸沉法[10]、酶法、盐法等。超声波[11]可以破坏掉植物的细胞壁及细胞膜，使细胞内的各种物质溶出，从而增加蛋白溶出率。因此，采用超声辅助碱法提取藜麦蛋白，通过单因素试验和响应面法对藜麦蛋白提取工艺进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 设备器材

AL204电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；RHP-100高速多功能粉碎机（永康市荣浩工贸有限公司）；JY92-2D超声波细胞粉碎机（寧波新芝生物科技股份有限公司）；H1850医用离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）；V-1100D可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（常州市亿能实验仪器厂）；DF-101S-2L分体式磁力搅拌机（南北仪器有限公司）；NKB3000微量凯氏定氮仪（上海祎鸿分析仪器有限公司）；pH试纸；各类试管烧杯等。

1.1.2 材料及试剂

藜麦种子；氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、石油醚、85%磷酸溶液（西北民族大学实验室）；牛血清蛋白（赛默飞生物有限公司）；G-250考马斯亮蓝（上海酶联生物科技有限公司）。试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 藜麦蛋白的提取工艺

优质藜麦种子→粉碎→0.180 mm（80目）过筛→石油醚脱脂→干燥→蒸馏水调浆→NaOH调节pH→超声波粉碎辅助→过滤上清液→蛋白提取液→测定蛋白质含量

称取一定质量的藜麦种子，用温水清洗除去皂苷，在45 ℃环境中干燥，用粉碎机中粉碎，过筛后获得藜麦粉，此过程中适当减小物料的粒径有利于蛋白的溶出，因此可采用小孔径目筛。取适量藜麦粉用石油醚进行脱脂操作，为保险起见可进行2次脱脂，每次脱脂时间不得低于4 h，脱脂完成后放在通风厨里挥发24 h，获得干燥的脱脂藜麦粉。

利用电子分析天平准确称取0.5 g脱脂藜麦粉于试管内，按照一定料液比加入蒸馏水，NaOH溶液（1 mol/L）调节混合溶液的pH，置于恒温水浴锅中振荡搅拌，保持恒定温度加热，可同步利用超声波细胞粉碎机按照一定功率超声指定的时间，浸提达到设置时间后取出，将离心机转速设定为3 500 r/min，放入试管离心15 min，分离上清液，取上清液通过G-250考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量，为避免因溶液中蛋白浓度过大导致超出测试范围的情况发生，可先取少量提取液以蒸馏水稀释10倍后再进行测试，通过计算得出超声波辅助碱法提取藜麦蛋白提取率。

1.2.2 藜麦蛋白提取率的计算

脱脂藜麦粉的总蛋白的含量通常采用凯氏定氮法[12]进行测定，通过G-250考马斯亮蓝染色法[13]测定提取液中的蛋白质含量。蛋白提取率按式（1）计算。

1.2.3 单因素试验设计

参考王棐等[14]的试验方法，使用水浴加热作为整个反应过程的外部环境，将温度设置为45 ℃，提取时间设置为3 h，维持这2个条件不变。研究超声功率、提取pH、料液比和超声时间4个因素对藜麦蛋白提取率的影响。选择：超声功率的梯度分别为200，280，360和440 W；提取pH分别为8，9，10和11；料液比分别为1︰10，1︰15，1︰20和1︰25 g/mL；超声时间分别为10，20，30和40 min。

1.2.4 响应面试验

对单因素试验结果进行分析后，设计因素A（超声功率）、B（pH）、C（料液比）、D（超声时间）为自变量，以藜麦蛋白提取率作为响应值，设计四因素三水平的响应面试验（共29组），各个因素水平设计见表1。

表1 响应面试验因素及水平

1.2.5 统计处理

试验结果数据利用Excel软件和Design Expert软件进行处理和分析，得出回归性方程和模型。其中：回归性方程的显著性分析判断标准为p＞0.05，变化不显著；p＜0.05，变化显著；p＜0.001，判定为极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

结果表明各个单因素在超声功率280 W、浸提pH 10、料液比1∶20（g/mL）、超声时间30 min的工艺参数下，藜麦蛋白的提取率最高。且该试验最佳条件独立，互相不影响。

2.1.1 超声功率对藜麦蛋白提取的影响

由图1可知，随着超声功率升高，藜麦蛋白提取率开始增高，超声功率280 W时提取率达到峰值，但是继续增加超声功率后提取率反而开始下降。出现这种情况的原因可能是超声功率过大，破坏了蛋白质结构，导致蛋白质开始部分分解及变性，继而致使藜麦蛋白提取率降低。因此，最佳提取功率为280 W，且差异性显著。

图1 超声功率对藜麦蛋白提取的影响

2.1.2 pH对藜麦蛋白提取的影响

由图2可知，初始藜麦蛋白提取率和pH呈现一个正相关趋势，在pH 10时达到峰值，随后开始降低，可能是因为过高的碱度抑制蛋白活性，使得藜麦蛋白不容易分离出来导致提取率降低。藜麦蛋白的最佳提取条件为pH 10，且差异性显著。

图2 提取pH对藜麦蛋白提取的影响

2.1.3 料液比对藜麦蛋白提取的影响

由图3可知，伴随提取液比例增大，藜麦蛋白的提取率也随之升高，总体呈现正相关趋势。在1︰20（g/mL）时达到峰值，继续增大提取液比例，藜麦蛋白提取率反而开始下降。这可能是因为随着提取溶剂增加，藜麦蛋白充分浸出，使得蛋白分子开始更多地与水结合；达到峰值后，溶剂增多，藜麦蛋白过度膨胀，与水的结合力随之降低。1︰20和1︰25（g/mL）差异性不显著，综合考虑，最佳料液比选择1︰20（g/mL）。

图3 料液比对藜麦蛋白提取的影响

2.1.4 超声时间对藜麦蛋白提取的影响

由图4可知，随着超声时间增加，藜麦蛋白提取率呈现先升高再下降的波动趋势，在30 min时藜麦蛋白提取率达到最高值，随后开始下降。原因可能是超声时间过长会导致藜麦蛋白的结构会遭到破坏，让蛋白分子暴露更多的疏水基团，使蛋白分子在溶剂中的溶解度下降，提取率降低。30和40 min差异性不显著，以试验结果来看，应该选取超声时间30 min作为藜麦蛋白提取的最佳条件。

图4 超声时间对藜麦蛋白提取的影响

2.2 藜麦蛋白超声辅助碱提法工艺优化

根据Box-Behnken中心组合设计（BBD）的试验原理，以单因素试验结果数据为基础，把对藜麦蛋白的提取率起主要影响的4个因素作为要考察的因素，把响应值即藜麦蛋白的提取率作为考察指标，进行四因素三水平的响应面分析试验，使用Design-Expert软件进行数据分析处理，求出数学模型，进而分析得到最佳的提取条件。超声辅助碱提藜麦蛋白的试验的结果见表2。

对表2的数据进行多元回归拟合分析，将各个试验数据导入Design-Expert软件，得到藜麦蛋白提取率与超声功率（A）、pH（B）、料液比（C）和超声时间（D）相关性的回归方程。根据分析回归方程可得出试验模型是否可靠。

表2 超声辅助碱法提取藜麦蛋白响应面试验设计及结果

2.2.1 回归方程及方差分析结果

回归模型方差分析见表3，回归方程为Y=66.84+0.47A+0.099B+10.66C+1.09D-1.00AB-1.97AC-0.12AD+0.35BC-1.16BD+1.55CD+1.69A2-0.94B2-5.77C2-0.62D2。

由表3可知，模型F值为13.24，p值小于0.000 1，表示差异显著。回归决定系数R2=0.930＞0.9，模型相关性好，Radj2=0.910，表示91%的试验数据可用模型解释，而失拟项p=0.070 8＞0.05，不显著，表示模型的拟合程度良好，可以比较真实反映实际情况，该模型可靠。综合考量F值及p值，经过比较得出各因素对藜麦蛋白提取率的影响顺序按大小排列为C＞D＞A＞B，即料液比＞超声时间＞超声功率＞pH。

表3 回归模型方差分析表

2.2.2 响应面分析与条件优化

由图5响应面三维图反映各因素对藜麦蛋白提取率的影响，影响力大小主要通过曲面的弧度进行体现。曲面图的倾斜程度越高，表示此两因素的交互作用对提取率的影响越显著，反之则越不显著。

图5 两因素交互作用对藜麦蛋白提取率的响应面曲面图

观察响应面三维图像，可以直观看出两变量交互作用的CD曲面最陡，藜麦蛋白的提取率与料液比和超声时间二者都呈现正相关的趋势，而交互作用AD、BD的曲面陡峭程度最小，提取率相对二者变化不明显。按影响的大小顺序为曲面CD＞曲面AC＞曲面BC＞曲面AB＞曲面AD＞曲面BD，即料液比和超声时间、超声功率和料液比、pH和料液比、超声功率和pH，每2个因素间交互作用对提取率影响都很明显，但是超声功率和超声时间、pH和超声时间的交互作用对于藜麦蛋白的提取影响较弱。

通过Design-Expert软件预测得到超声辅助藜麦蛋白碱提法的最佳工艺参数预测结果：超声功率200 W、pH 9.205、料液比1∶25（g/mL）、提取时间40 min，蛋白提取率的最高预测值为77.083%。在实际操作中，为使操作方便，将试验参数调整为超声功率200 W、pH 9.5、料液比1∶25（g/mL）、提取时间40 min。在该条件下藜麦蛋白提取率为75.24%，与模型的预测值出入不大，从侧面验证基于响应面模型所得的优化提取参数可靠。

3 结论

相比于其他提取方法，超声波提取法具有操作简便、试验操作过程安全节能等优点。Liang等[15]发现利用超声波能够提高大豆蛋白溶出率，提高大豆蛋白提取率，且与单纯的碱法提取相比，提取效率提高11.6%。杨立宾等[16]研究利用超声波辅助提取松仁蛋白的工艺，相对传统提取方法，该方法可大幅节省提取时间，也明显提高松仁蛋白提取率。试验利用超声波辅助碱法提取藜麦蛋白，结果表明，该处理方式确实能提高藜麦蛋白提取率，达到75.24%。藜麦蛋白提取的最佳参数为超声功率200 W、pH 9.5，料液比1∶25 g/mL、提取时间40 min。4种因素对藜麦蛋白的提取率影响大小次序为料液比＞超声时间＞超声功率＞pH。