TMPRSS4基因沉默对胰腺癌SW1990细胞生长及侵袭的影响

王焕景 智发朝 赵芯梅 青海涛 伦伟健 周三喜 郭文 程天明 姜泊

·论著·

TMPRSS4基因沉默对胰腺癌SW1990细胞生长及侵袭的影响

王焕景 智发朝 赵芯梅 青海涛 伦伟健 周三喜 郭文 程天明 姜泊

目的观察TMPRSS4基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞体外生长增殖和侵袭的影响。方法体外合成4个靶向TMPRSS4基因和阴性对照的真核表达载体，瞬时转染到SW1990细胞，实时定量PCR法检测转染细胞的TMPRSS4 mRNA表达。以干扰效率最高的真核表达载体转染SW1990细胞， G418筛选出稳定的TMPRSS4基因沉默的细胞株，蛋白质印迹法检测稳定细胞株 TMPRSS4蛋白抑制效率，CCK-8法检测细胞生长抑制率，Transwell小室检测细胞侵袭能力。结果成功构建了稳定下调TMPRSS4表达的细胞株SW1990/psi-TMPRSS4， 细胞转染效率为82.9%。与亲本SW1990细胞比较，TMPRSS4 mRNA和蛋白水平分别下调了80.1%、60%。 SW1990/psi-TMPRSS4组穿膜细胞数为(118.6±13.4)个，显著低于阴性对照组的(157.4±12.9)个和亲本细胞组的(157.0±9.5)个(P值均<0.01)。SW1990/psi-TMPRSS4组细胞的侵袭抑制率为24.5%。但各组细胞增殖无明显变化。结论成功筛选出稳定下调TMPRSS4表达的细胞株。下调TMPRSS4表达能有效抑制胰腺癌SW1990细胞的侵袭能力，但对细胞增殖无影响。

胰腺肿瘤； 小分子干扰RNA; 基因沉默； TMPRSS4; SW1990细胞

跨膜丝氨酸蛋白酶4(type Ⅱ transmembrane serine proteases 4，TMPRSS4)是Wallrapp等[1]在2000年从胰腺癌中分离出的糜蛋白家族(TTSPs)中的一个新的丝氨酸蛋白酶，它具备TTSP所有的结构特征，功能上有胰酶样活性，可能在肿瘤转移及浸润中有重要作用。Jung等[2]研究证实，TMPRSS4过表达诱导E-钙粘蛋白介导的细胞粘连丧失，从而促进表皮细胞-间质细胞转变，使癌细胞的转移、侵袭能力和恶性程度明显增加。本研究观察胰腺癌SW1990细胞TMPRSS4基因表达沉默后细胞的增殖及侵袭行为的变化，探讨TMPRSS4与胰腺癌浸润转移的关系。

材料和方法

一、细胞培养

SW1990胰腺癌细胞由本实验室保存，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基常规培养、传代。收集对数生长期细胞进行实验。

二、靶向TMPRSS4的shRNA的设计、合成及真核表达质粒的构建

根据Gen-Bank(NM-019894.3)序列设计4个靶向TMPRSS4基因的shRNA，分别为TMPRSS4-1：GGATCTGGATGTTGTTGAAAT；TMPRSS4-2：GCTGCA-GTTCCACTCACTTT；TMPRSS4-3：GGGAAGTCACCG-AGAAGATGA；TMPRSS4-4：GCTGCAGTTCCCACTCACTTT。同时合成阴性对照NC-shRNA，序列为GTTCTCCGAACGTGTCAGT。由上海吉玛公司合成真核载体，分别命名为psi-TMPRSS4-1、psi-TMPRSS4-2、psi-TMPRSS4-3、psi-TMPRSS4-4、psi-NC。真核载体内含GFP荧光蛋白。

三、细胞瞬时转染及真核表达载体的选择

SW1990细胞以8×105个/ml接种于6孔板，培养24 h后用无血清DMEM高糖培养液分别加入4个psi-TMPRSS4和psi-NC各4 μg以及10 μl LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)转染8 h，换含有10%胎牛血清的培养液继续培养48 h。以未转染细胞作为对照组。分别收集各组细胞，抽提细胞总RNA，逆转录cDNA，然后行实时定量PCR检测转染细胞TMPRSS4 mRNA表达。引物序列：TMPRSS4上游5′-CCGATGTGTTCAACTGGAAG-3′，下游5′-CCCATCCAATGATCCAGAGT-3′；内参GAPDH上游5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′，下游5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3′，引物由上海生工公司合成。PCR扩增条件：50℃ UDG孵育2 min，95℃ 2 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s，40个循环。每组设3个复孔。应用2-△△CT法计算转染各组的RQ值。

四、稳定转染细胞株的筛选

以1.0×105个/ml接种于24孔板中，psi-TMPRSS4-2转染SW1990细胞，培养8 h后换含10%胎牛血清的培养液，48 h后以终浓度为600 μg/ml的G418(Gibco公司)进行筛选。4周后挑取抗性克隆，用有限稀释法将挑取的克隆在96孔板中用含600 μg/ml G418的培养液扩大培养。待长出单细胞克隆后移入培养瓶以300 μg/ml的G418维持浓度继续培养。得到的稳定干扰TMPRSS4基因的细胞株命名为SW1990/psi-TMPRSS4。同时阴性siRNA 转染的细胞命名为SW1990/psi-NC。

五、蛋白质印迹法检测TMPRSS4蛋白表达

提取SW1990、SW1990/psi-NC、SW1990/psi-TMPRSS4三组细胞的总蛋白，常规行蛋白质印迹法。兔抗人TMPRSS4多抗(GLP公司)1∶500稀释。以β-actin为内参。采用Image-Pro Plus图像分析软件计算各条带灰度值，以目的条带与β-actin灰度比值表示蛋白相对表达量。蛋白表达抑制率=(对照组值-实验组值)/对照组值×100%。

六、Transwell小室法检测细胞侵袭力

收集对数生长期细胞，无血清培养基洗涤2次后调整细胞密度为1×106/ml。加100 μl细胞悬液于Transwell上室(Corning公司)，加500 μl含10%胎牛血清的完全培养基于下室，37℃培养24 h后擦去上室侧未穿膜细胞，4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫染色5 min，蒸馏水洗数次，空气中风干。选取5个高倍视野，计数穿膜细胞数。侵袭抑制率=(对照组侵袭穿膜细胞数-实验组侵袭穿膜细胞数)/对照组侵袭穿膜细胞数×100%。

七、CCK-8法检测细胞增殖

将对数生长期的SW1900、SW1900/psi-NC、SW1900/psi-TMPRSS4细胞以1×104个/ml接种在96孔板中，每孔100 μl，培养24、48、72 h后分别加入10 μl CCK-8原液，继续培养2 h，测450 nm波长的吸光度(A450)值。每组设5个复孔。

八、统计学处理

结 果

一、靶向TMPRSS4真核表达载体的选择

对照组、psi-NC及psi-TMPRSS4-1、2、3、4组的RQ值分别为1.000、0.964、0.337、0.199、0.573、0.354；基因表达沉默率分别为0、3.6%、66.3%、80.1%、42.7%、64.6%，以psi-TMPRSS4-2干扰效率最高。故选其进行以下实验。

二、TMPRSS4真核表达载体转染率及TMPRSS4 mRNA表达沉默效果

未转染质粒的SW1990细胞在荧光显微镜下未见绿色荧光。转染质粒的细胞可见绿色荧光(图1)。SW1990/psi-NC细胞的TMPRSS4蛋白表达量较亲本SW1990细胞抑制15%，而SW1990/psi-TMPRSS4细胞的TMPRSS4蛋白表达抑制率约为60%(图2)。

图1psi-NC(a)和psi-TMPRSS4(b)转染的阳性SW1990细胞(×100)

图2转染后细胞TMPRSS4蛋白的表达(蛋白质印迹法)

三、转染细胞体外侵袭力的变化

SW1990组、SW1990/psi-NC组、SW1990/psi-TMPRSS4组的平均穿膜细胞数分别为(157.0±9.5)、(157.4±12.9)和(118.6±13.4)个(图3)，SW1990组与SW1990/psi-NC组间差异无统计学意义，但该两组与SW1990/psi-TMPRSS4组差异均具有统计学意义(P值均=0.001 )。SW1990/psi-TMPRSS4组细胞的侵袭抑制率为24.5%。

四、转染细胞增殖活性的变化

SW1990、SW1990/psi-NC、SW1990/psi-TMPRSS4三组细胞24 h的增殖活性分别为0.95±0.04、0.93±0.38、0.85±0.10；48 h为1.12±0.06、1.13±0.14、1.11±0.12；72 h为3.87±0.06、3.87±0.18、3.92±0.16，各组间差异均无统计学意义。

图3SW1990组(a)、SW1990/psi-NC组(b)、SW1990/psi-TMPRSS4组(c)的穿膜细胞(结晶紫 ×200)

讨 论

TMPRSS4也被称为MT-SP2，定位于11q23.3。基因全长48565 bp，共有13个外显子， 437个氨基酸，分子质量为48000。Wallrapp等[1]报道， 13例原发性胰腺癌组织中9例TMPRSS4高表达，16株胰腺癌细胞系中10株高表达；而正常胰腺及慢性胰腺炎组织中未见TMPRSS4表达。但TMPRSS4与胰腺癌细胞生物学行为的关系尚不清楚。

SW1990细胞TMPRSS4表达量较高。为此，本实验应用RNAi技术抑制SW1990细胞TMPRSS4基因表达。转染后细胞TMPRSS4 mRNA表达水平较亲本细胞下降80.1%，蛋白下降60%，表明干扰TMPRSS4成功。TMPRSS4沉默细胞的侵袭能力被抑制24.5%，证明TMPRSS4的表达与SW1990的侵袭转移行为有密切关系。表明TMPRSS4可能并不参与细胞的增殖，TMPRSS4基因沉默不影响SW1990细胞的增殖。

[1] Wallrapp C, Hahnel S, Muller-Pillasch F, et al. A novel transmembrane serine protease (TMPRSS3) overexpressed in pancreatic cancer. Cancer Res, 2000, 60: 2602-2606.

[2] Jung H,Lee KP,Park SJ,et al.TMPRsS4 promotes invasion,migration and metastasis of human tumor cells by facilitating an epithelial-mesenchymal transition.Oncogene,2008,27:2635-2647．

2010-06-10)

(本文编辑：吕芳萍)

InfluenceofsilencingTMPRSS4expressionongrowthandinvasionofpancreaticcancerSW1990cell

WANGHuan-jing,ZHIFa-chao,ZHAOXin-mei,QINGHai-tao,LUNWei-jian,ZHOUSan-xi,GUOWen,CHENGTian-ming,JIANGBo.

InstituteofDigestiveMedicine，NanfangHospital，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，China

Correspodingauthor：ZHIFa-chao，Email，zfc@fimmu.com

ObjectiveTo study the influence of the small interfering RNA (siRNA) interference TMPRSS4 expression on human pancreatic cancer SW1990 cell′s proliferation and invasion.MethodsThe four eukaryotic expression vector of TMPRSS4 gene were synthesized in vitro and were transfected transiently into human pancreatic cancer SW1990 cells. TMPRSS4 mRNA expression of transfected cells was detected by real-time RT-PCR. The most efficient eukaryotic expression vector was used to be transfected into SW1990 cells. By using G418, cell strain that can silence TMPRSS4 gene stably was screened. The TMPRSS4 mRNA expression of the stable cell strain was detected by real time PCR TMPRSS4 protein expression was detected by western blot. The proliferation ability of transfected SW1990 cells was detected by CCK-8 method. By Transwell, the invasion change of SW1990 cell was detected.ResultsA stable cell strain, SW1990/psi TMPRSS4, was successfully constructed, in which the expression level of TMPRSS4 could be reduced stably by RNA interference. Cell transfection efficiency was 82.9%. Compared with the control group, the TMPRSS4 mRNA and protein levels were reduced by 80.1% and 60%,and number of penetrating cells was 118.6±13.4 in SW1990/psi TMPRSS4 group, which was significantly lower than those in the negative control group (157.4±12.9) and control group (157.0±9.5,P<0.01). Cells invasion inhibitory rate was 24.5% in SW1990/psi TMPRSS4 group. The cell proliferation was not significantly different among all the groups.ConclusionsA stable cell strain is screened successfully in which the expression level of TMPRSS4 can be reduced stably. The down-regulation of TMPRSS4 gene expression level can inhibit the invasion of SW1990 cells, but has no effect on cell proliferation.

Pancreatic neoplasms; Small interfering RNA; Gene silencing; TMPRSS4; SW1990 cell

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.012

510515 广州，南方医科大学南方医院消化病研究所

智发朝，Email，zfc@fimmu.com