氧化苦参碱对人胰腺癌细胞株SW1990侵袭转移能力的影响

李飞 谢立群 冀润利 周静 郑艳敏 刘彩菊 段泽新

·论著·

氧化苦参碱对人胰腺癌细胞株SW1990侵袭转移能力的影响

李飞 谢立群 冀润利 周静 郑艳敏 刘彩菊 段泽新

目的探讨氧化苦参碱对人胰腺癌细胞株SW1990体外迁移及侵袭能力的影响及其作用机制。方法体外培养人胰腺癌SW1990细胞株，用氧化苦参碱处理SW1990细胞后，采用MTT法检测细胞增殖；通过细胞黏附实验、细胞划痕实验及Transwell小室检测细胞的黏附、迁移及侵袭能力； RT-PCR法检测细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA的表达； ELISA法检测细胞VEGF蛋白的含量。结果氧化苦参碱呈剂量和时间依赖性抑制SW1990细胞的增殖。2 mg/ml氧化苦参碱处理SW1990细胞1 h后，细胞的体外黏附抑制率为(35.23±8.56)%；处理24 h后，细胞的过河时间为(65.46±4.25)h，较对照组的(34.50±4.12)h显著延长(P<0.05)；穿膜细胞数为(91.9±9.6)个，较对照组的(144.2±17.2)个显著减少(P<0．05)；细胞VEGF、MMP-2 mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌量均显著下调[0.515±0.063比0.817±0.054，0.343±0.072比0.650±0.068，(265.50±5.45)pg/ml比(441.06±16.70)pg/ml，P值均<0．05]。结论氧化苦参碱可能通过抑制MMP-2和VEGF表达进而抑制胰腺癌SW1990细胞的增殖、黏附、迁移及侵袭能力。

胰腺肿瘤； 氧化苦参碱； 肿瘤侵润； 肿瘤转移

80%的胰腺癌患者在临床确诊时已发现有局部侵犯及血行、淋巴转移， 5年生存率低于5%[1]。氧化苦参碱(oxymatrine,OM)是从中药苦参中提取的一种生物碱，具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗肝纤维化、免疫及生物反应调节等作用[2-3]。其抗肿瘤活性主要为抑制肿瘤细胞增殖和转移、促进凋亡，以及诱导分化等[4-6]。本实验观察氧化苦参碱对人胰腺癌细胞株SW1990细胞增殖、黏附、迁移及侵袭力的影响，探讨氧化苦参碱的抗肿瘤作用机制，为其临床应用提供一定的实验依据和理论基础。

材料与方法

一、MTT法检测SW1990细胞增殖

人胰腺癌细胞株SW1990由中国科学院上海细胞生物研究所提供，常规培养传代。取对数生长期细胞，每孔5×103个细胞接种于96孔板，常规培养24 h后改无血清培养液培养12 h，然后加入终浓度分别为1、2、4、8、16 mg/ml的氧化苦参碱(江苏正大天晴药业股份有限公司，国药准字H20057480)继续培养24、48、72 h，以不加氧化苦参碱为对照组，单纯培养液为空白组。每孔加入5 mg/ml MTT溶液(Sigma公司)20 μl后再培养4 h，1500 r/min离心10 min，每孔加入DMSO 150 μl，振荡10 min，在全自动酶标仪(Bio-Rad550型)上测490 nm波长吸光度(A490)值。每组设8个复孔，实验重复3次。细胞的生长抑制率(IR)=(对照组A490值-处理组A490值)/(对照组A490值-空白组A490值)×100%。

二、细胞黏附实验

96孔板每孔铺Matrigel 30 μg，置37℃培养箱中过夜待用。每孔加入2500个用1、2、4 mg/ml氧化苦参碱处理24 h的SW1990细胞(50 μl)，以不加氧化苦参碱作为对照组，继续培养1 h，每组设3个复孔。PBS洗去未黏附细胞，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl后再培养4 h。弃去MTT，加入150 μl DMSO，测A490值。细胞黏附抑制率=(对照组A490值-处理组A490值)/对照组A490值×100%。

三、细胞划痕实验

取对数生长期的SW1990细胞，按每孔5×105个细胞量加入24孔板，待细胞培养至基本铺满后弃培养液，用100 μl Tip吸头在孔中划一直线。加入终浓度分别为1、2、4 mg/ml的氧化苦参碱，以不加氧化苦参碱作为对照组。培养24 h后每2 h观察1次，直至划痕被细胞填满。观察过河所需时间。每组设5个复孔，实验重复3次。

四、细胞侵袭实验

取对数生长期SW1990细胞，用无血清培养液孵育12 h，胰酶消化，调整细胞数至5×105/ml个。Transwell趋化小室(孔径6.5 mm，Millipore公司)的上室加入200 μl单细胞悬液及200 μl终浓度分别为1、2、4 mg/ml的氧化苦参碱，以不加氧化苦参碱作为对照组；下室加600 μl条件培养液。常规培养24 h，取出滤膜，刮净上室细胞，下层黏附的穿膜细胞用95%乙醇固定10 min，苏木精染色15 min，200倍光镜下随机取5个视野，计数穿膜细胞数。每组3个趋化小室，实验重复3次。

将50 μg Matrigel胶用4℃ DMEM培养液1∶4稀释，分3次涂于Transwell小室微孔滤膜上，每次间隔10 min。包被后用紫外线照射2 h杀菌，使用前上室加少量无血清培养基室温水化2 h。重复上述细胞侵袭实验，共3次。

五、RT-PCR法检测细胞VEGF、MMP-2 mRNA表达

取对数生长期细胞，以5×105/ml个接种于25 ml培养瓶中培养，24 h后用无血清H-DMEM培养12 h，再用1、2、4 mg/ml氧化苦参碱处理细胞24 h，对照组不加氧化苦参碱。收集细胞，用Trizol提取细胞总RNA，鉴定其纯度及完整性。应用Omiga2.0设计引物，VEGF上游引物5′-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3′，下游引物5′-TCTCTCCTATGTGCTGGCCT-3′，产物311 bp；MMP-2上游引物5′-CAGGCTCTT-CTCCTTTCACAAC-3′，下游引物5′-AAGCCACGGCTT-GGTTTTCCTC-3′，产物398 bp；内参β-actin上游引物5′-TGTTTGAGACCTTCAACACCC-3′，下游引物5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′，产物540 bp。引物由大连宝生物工程有限公司合成。逆转录条件：30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min；PCR反应条件： 94℃ 1 min，61℃ 45 s(VEGF)或55℃ 1 min (MMP-2)或58℃ 30 s(β-actin)，72℃ 1 min， 30个循环，72℃ 5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶自动成像2000系统扫描，以目的条带与β-actin条带的灰度值比表示mRNA相对表达量。

六、ELISA法检测细胞培养上清VEGF蛋白含量

取上述各组细胞培养上清液，ELISA法检测VEGF蛋白含量。ELISA试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司，按说明书操作，根据标准曲线换算VEGF含量。

七、统计学分析

结 果

一、氧化苦参碱对SW1990细胞增殖的影响

氧化苦参碱呈浓度-时间性抑制细胞增殖(图1)。16 mg/ml氧化苦参碱处理细胞24 h的增殖抑制率高达82.9%，但1、2、4 mg/ml氧化苦参碱对细胞的增殖抑制率均<10%，故取这三种浓度进行其他相关实验。

图1 不同浓度氧化苦参碱对SW1990细胞增殖的影响

二、氧化苦参碱对SW1990细胞黏附的影响

对照组A490值为1.10±0.16，1、2、4 mg/ml氧化苦参碱组A490值分别为0.88±0.12、0.71±0.20和0.59±0.18，均较对照组显著降低(P<0．05)。1、2、4 mg/ml氧化苦参碱组的黏附抑制率分别为(20.16±4.24)%、(35.23±8.56)%和(46．83±7.26)%，呈明显量效关系。

三、氧化苦参碱对SW1990细胞迁移的影响

对照组过河时间为(34.50±4.12)h，1、2、4 mg/ml氧化苦参碱组过河时间分别为(48.80±3.56)、(65.46±4.25)和(70.54±3.53)h，均较对照组显著延长(P<0．05，图2)，且随浓度增加而延长。

四、氧化苦参碱对SW1990细胞侵袭力的影响

氧化苦参碱组细胞穿膜数呈浓度依赖性下降。对照组穿膜细胞数为(144.2±17.2)个，1、2、4 mg/ml氧化苦参碱组分别为(117.1±13.6)、(91.9±9.6)和(77.4±8.4)个，均较对照组显著减少(P<0．05)。应用Matrigen包被后，对照组及1、2、4 mg/ml氧化苦参碱组穿膜细胞数分别为(102.4±11.2)、(84.2±9.3)、(69.1±8.8)和(57.9±6.1)个，氧化苦参碱组亦均较对照组显著减少(图3)，且呈浓度依赖性。

图2对照组(a)及1(b)、2(c)、4(d)mg/ml氧化苦参碱组的细胞划痕实验(36 h ×100)

图3对照组(a)及1(b)、2(c)、4(d)mg/ml氧化苦参碱组的细胞穿膜数( ×100)

五、氧化苦参碱对SW1990细胞VEGF、MMP-2 mRNA表达及VEGF蛋白分泌的影响

对照组及1、2、4 mg/ml氧化苦参碱组细胞VEGF mRNA表达量分别为0.817±0.054、0.612±0.088、0.515±0.063和0.322±0.025；MMP-2 mRNA表达量分别为0.650±0.068、0.492±0.052、0.343±0.072和0.236±0.078，均较对照组显著降低(P<0．05，图4) ，且呈浓度依赖性。

对照组及1、2、4 mg/ml氧化苦参碱组细胞VEGF蛋白分泌量分别为(441.06±16.70)、(356.09±16.52)、(265.50±5.45)和(158.11±17.69)pg/ml，氧化苦参碱各组均显著低于对照组(P值均<0．05)，且呈浓度依赖性 。

讨 论

从分子水平看，恶性肿瘤侵袭、转移的过程首先是癌细胞与癌细胞间的黏附松解，然后癌细胞通过溶解蛋白侵入周围的细胞外基质，再进入血管及淋巴管。在血液(淋巴)循环中，肿瘤细胞逃脱机体的免疫防御机制，黏附在转移器官血管床的血管内皮上，继而脱离其血管系统，侵入靶器官，从此开始增殖，并形成新生血管。因此黏附是癌细胞侵袭的起始步骤，随后经癌细胞的迁移、侵袭等方式实现转移的结果。

1、2、3：1、2、4 mg/ml氧化苦参碱组；4：对照组

图4各组SW1990细胞VEGF(上)、MMP-2(下) mRNA的表达

本体外实验结果显示，氧化苦参碱呈浓度-时间依赖性抑制胰腺癌细胞SW1990的增殖、黏附及迁移，与文献报道的氧化苦参碱对其他癌细胞的作用相似。

在肿瘤的侵袭和转移过程中，细胞外基质的降解和促血管生成因子诱导的新生血管形成起着重要作用[7-8]。基质金属蛋白酶家族(MMPs)是人体内降解细胞外基质的主要酶类，特别是MMP-2和MMP-9在肿瘤细胞的浸润和转移灶的形成过程中起重要作用。研究表明，胰腺癌MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白的表达增加[9]，其表达上调可促进胰腺癌细胞浸润[10]。

VEGF是作用最强、特异性最高的促血管生长因子之一，在肿瘤等病理情况下表达可异常增加，促进肿瘤侵袭和转移。Itakura等[11]报道，胰腺癌组织VEGF mRNA含量是正常胰腺组织的5倍以上，75例胰腺癌患者中64例VEGF蛋白表达阳性，VEGF表达与微血管密度水平、肿瘤大小、局部浸润相关，但与生存率无关。研究还表明，胰腺癌MMP-2、VEGF

的表达与胰腺癌的转移密切相关[12-13]。本实验结果显示，胰腺癌SW1990细胞有MMP-2、VEGF mRNA的表达，经氧化苦参碱处理后，SW1990细胞MMP-2、VEGF mRNA表达量呈浓度依赖性下降，VEGF蛋白含量呈浓度依赖性减少。表明氧化苦参碱可能通过下调MMP-2和VEGF的表达抑制胰腺癌SW1990细胞的侵袭和转移。

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2010-10-18)

(本文编辑：吕芳萍)

InfluenceofoxymatrineonmetastaticandinvasiveabilityofhumanpancreaticcancercelllineSW1990

LIFei，XIELi-qun，JIRun-li，ZHOUJing，ZHENGYan-min，LIUCai-ju，DUANZe-xin.

FirstDepartmentofInternalMedicine,XinjiangProductionandConstructionCorpHospitalofChinesepeople′sArmedPoliceForce,Urumqi830063,China

Correspondingauthor:XIELi-qun,Email:xieliqun66@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of oxymatrine on invasion and metastasis of human pancreatic cancer line SW1990 in vitro.MethodsHuman pancreatic cancer cell line SW1990 was cultured in vitro. Oxymatrine was added into the culture media of SWl990 cells. Then MTT assay was used to determine the effect on proliferation. The adhesive capability, the mobile ability and invasive ability of SWl990 cells were detected by the adhesion assay, the crossing-river test, the transwell migration assay and the matrigel invasion method, respectively. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of MMP-2 and VEGF. ELISA method was used to detect the protein levels of the VEGF.ResultsThe growth of SWl990 cells was inhibited by oxymatrine in a dose and time-dependent manner. After 2 mg/ml of oxymatrine treatment for SW1990 cells for 1 h, the adhesive capability inhibitory rate was (35.23±8.56) %; 24 h later, crossing-river time was (65.46±4.25) h, which was significantly longer than that in control group [(34.50±4.12) h,P<0.05)], the number of penetrating cells was 91.9±9.6, which was significantly lower than that in control group (144.2±17.2,P<0.05). The mRNA expression of MMP-2 and VEGF, expression of protein of VEGF in SW1990 cells was significantly down-regulated [0.515±0.063vs. 0.817±0.054, 0.343±0.072vs. 0.650±0.068; (265.50±5.45) pg/mlvs. (441.06±16.70) pg/ml,P<0.05].ConclusionsOxymoron can inhibit the invasion and metastasis ability of pancreatic cancer line SW1990 in vitro, and the mechanism is possibly related to the down-regulation of MMP-2 and VEGF expression．

Pancreatic neoplasms； Oxymatrine； Neoplasm invasiveness； Neoplasm metastasis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.008

青岛市科技基金项目(2008-wszo1003)

830063 乌鲁木齐，新疆武警兵团指挥部医院内一科(李飞)；武警医学院附属医院消化内科(谢立群、冀润利、周静、郑艳敏、刘彩菊、段泽新)

谢立群，Email:xieliqun66@hotmail.com