CⅡTA基因调控胰腺肿瘤细胞MHCⅡ类分子表达的体外研究

江静娴 张敏敏 杨骅 吴洪玉 邹多武 李兆申

·论著·

CⅡTA基因调控胰腺肿瘤细胞MHCⅡ类分子表达的体外研究

江静娴 张敏敏 杨骅 吴洪玉 邹多武 李兆申

目的研究CⅡTA基因对人胰腺癌CaPanC-2细胞和小鼠胰腺癌PanC-02细胞主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子表达的影响。方法将携带CⅡTA基因的腺病毒(Ad-CⅡTA)分别感染人胰腺癌CaPanC-2细胞和小鼠胰腺癌PanC-02细胞，培养24、48、72 h。实时PCR法检测感染细胞CⅡTA mRNA的表达，蛋白质印迹法检测CⅡTA蛋白表达，流式细胞仪检测MHCⅡ类分子阳性表达细胞百分比。结果CaPanC-2细胞感染后24、48、72 h的CⅡTA mRNA表达量分别为对照组的(16769±6455)、(261568±348850)和(834816±97783)倍(P<0.05)；PanC-02细胞为对照组的(548546±87755)、(1242684±624888)和(1401647±726145)倍(P<0.05)。CaPanC-2和PanC-02细胞均不表达CⅡTA蛋白，感染后48 h，CaPanC-2、PanC-02细胞CⅡTA蛋白表达量为0.746±0.499和0.631±0.244。感染24、48、72 h组CaPanC-2细胞表达MHCⅡ类分子的细胞百分比分别为(8.1±0.3)%、(18.9±0.3)%、(78.5±0.9)%，显著高于对照组的(7.0±0.1)%(P<0.01)；PanC-02细胞表达MHCⅡ类分子的细胞百分比分别为(5.1±0.2)%、(37.3±2.0)%、(68.8±2.2)%，显著高于对照组的(2.2±0.2)%(P<0.01)。结论Ad-CⅡTA体外感染胰腺肿瘤细胞可促进CⅡTA基因的表达，从而促进细胞表面MHCⅡ类分子的表达。

胰腺肿瘤； 主要组织相容性复合物； 腺病毒； 感染

主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子的表达分为组成型和诱导型，其表达的调控主要在转录水平[1]。MHCⅡ类反式激活因子(MHC class Ⅱ transactivator,CⅡTA)是MHCⅡ类基因表达的“分子开关”，其对MHCⅡ类分子的表达调控有着专一性和有效性[2]。外源性CⅡTA能够促进MHCⅡ类基因转录的激活[3]，改变MHCⅡ类分子的表达，增强肿瘤的免疫原性及T细胞对肿瘤细胞的识别能力，促进肿瘤细胞抗原的递呈，从而达到激活机体免疫系统杀伤肿瘤细胞的目的[4]。为此，我们利用构建好的重组腺病毒载体Ad-CⅡTA体外感染胰腺癌细胞株CaPanC-2和PanC-02，证实通过腺病毒介导的外源性CⅡTA基因能够促进MHCⅡ类分子的表达，为胰腺癌的肿瘤免疫治疗提供了新的途径和启示。

材料和方法

一、腺病毒Ad-CⅡTA感染胰腺癌细胞株

人胰腺癌细胞株CaPanC-2和小鼠胰腺癌细胞株PanC-02为本实验室保存。携带CⅡTA基因的腺病毒(Ad-CⅡTA)为本实验室先期制备。细胞株常规培养传代后取对数生长期细胞，以每孔5×106个细胞接种于6孔板，加入含IFN-γ 500 U/ml(Peprotech公司)的培养基常规孵育48 h，换不含血清的opti-MEM培养基饥饿细胞4 h，加入Ad-CⅡTA转染两种细胞株，病毒量为100 MOI，8 h后更换为正常的含10%小牛血清的培养基继续培养24、48、72 h，在荧光倒置显微镜下观察呈现绿色荧光的感染细胞。

二、实时PCR法检测感染细胞CⅡTA mRNA表达

收集感染的细胞，应用Trizol裂解液(Takara公司)抽提细胞总RNA。引物序列：小鼠CⅡTA上游5′-AAGCAGGACAGAAGCCTCAGAA-3′，下游5′-GCTTCCTGTGCTTGAGTCCAT-3′，扩增片段369 bp；小鼠内参GAPDH上游5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，扩增片段233 bp；人CⅡTA上游5′-ACGCTT-TCTGGCTGGATTAGT-3′，下游5′-TCAACGCCA-GTCTGACGAAGG-3′，扩增片段342 bp；人内参GAPDH上游5′-TGACCCTGAAGTACCCCATTG-3′，下游5′-TCAGGATCTTCATGAGGTAG-3′，片段387 bp。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。逆转录和实时PCR试剂均购自Takara公司。逆转录条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。PCR反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 34 s，40个循环。采用相对定量2-△△Ct法计算mRNA表达倍数。△Ct值=目的基因Ct值-内参基因Ct值；△△Ct值=目的基因△Ct值-内参基因△Ct值；以对照组表达量为1，2-△△Ct值即为目的基因的表达倍数。实验重复5次，取均值。

三、蛋白质印迹法检测感染细胞CⅡTA蛋白表达

收集细胞后加入蛋白裂解液(Thermo公司)提取蛋白，取30 μg蛋白常规行蛋白质印迹法检测CⅡTA蛋白表达。小鼠抗人、兔抗小鼠CⅡTA单抗为Santa Cruz公司产品，HRP标记山羊抗鼠、山羊抗兔为上海博迈公司产品。以β-actin作为内参。最后ECL显影，图像分析仪扫描，以目的条带与β-actin条带灰度值比作为目的蛋白的相对表达量。

四、流式细胞仪检测感染细胞MHCⅡ类分子的表达

收集对照组和感染后24、48、72 h的细胞，PBS洗涤后加入荧光蛋白GFP标记的抗马MHC Ⅱ类(I-A/I-E)PE或抗人HLA-DR PE(eBioscience公司)孵育15 min进行标记，用PBS重悬细胞，流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分比。

五、统计学处理

结 果

一、细胞感染后CⅡTA mRNA表达的变化

Ad-CⅡTA感染后24、48、72 h，CaPanC-2细胞CⅡTA mRNA表达呈时间依赖性明显上调，分别为对照组的(16769±6455)、(261568±348850)和(834816±97783)倍(P<0.05)；PanC-02细胞CⅡTA mRNA表达亦呈时间依赖性明显上调，分别为对照组的(548546±87755)、(1242684±624888)和(1401647±726145)倍(P<0.05)。

二、细胞感染后CⅡTA蛋白表达的变化

CaPanC-2和PanC-02细胞均不表达CⅡTA蛋白。感染后48 h，CaPanC-2细胞CⅡTA蛋白表达量为0.746±0.499；PanC-02细胞的表达量为0.631±0.244(图1)。

1：CaPanC-2细胞的空白对照；2：腺病毒感染的CaPanC-2；3：PanC-02细胞的空白对照；4：腺病毒感染的PanC-02

图1各组细胞CⅡTA蛋白表达

三、感染后表达MHCⅡ类分子的细胞百分比

感染24、48、72 h组表达MHCⅡ类分子的CaPanC-2细胞百分比分别为(8.1±0.3)%、(18.9±0.3)%、(78.5±0.9)%，显著高于对照组的(7.0±0.1)%、(7.0±0.1)%、(6.9±0.2)%(P值均<0.01)；表达MHCⅡ类分子的PanC-02细胞百分比分别为(5.1±0.2)%、(37.3±2.0)%、(68.8±2.2)%，显著高于对照组的(2.2±0.2)%、(2.2±0.2)%、(2.1±0.3)%(P值均<0.01)。

讨 论

CⅡTA是在转录水平上调控MHCⅡ类分子表达的最关键因子之一,CⅡTA的表达降低可导致肿瘤细胞MHCⅡ类分子表达下降[4-6]，影响与MHCⅡ类分子相关的免疫功能[7]。Satoh等[5]证实，高水平的MHCⅡ类分子表达常与较好的肿瘤患者预后密切相关。因此，通过CⅡTA干预MHCⅡ类分子功能可能是治疗肿瘤的理想靶点。Lu等[8]应用细胞感染方法将肿瘤细胞感染成MHC(+)/Ii(-)表型，然后种植到BALB/c鼠成瘤，结果有效引发了CD4+Th细胞抗肿瘤免疫应答。Meazza等[9]用CⅡTA基因转染MHCⅡ缺乏的高度恶性的小鼠乳腺癌细胞株TS/A，恢复了MHCⅡ类分子抗原表达，使其重新获得了免疫原性。

本结果显示，人胰腺癌细胞株CaPanC-2和小鼠胰腺癌细胞株PanC-02均无CⅡTA的蛋白表达，感染后两株细胞株中CⅡTA mRNA和蛋白的表达较前显著增强，同时MHCⅡ类分子的表达亦显著增强。由此证明，利用重组腺病毒载体制备新型、高效的肿瘤疫苗，外源性加入CⅡTA基因，可增强胰腺肿瘤细胞表面MHCⅡ类分子的表达，进而促进T细胞对胰腺肿瘤细胞抗原的识别，介导T细胞激活，对胰腺癌细胞产生免疫治疗反应。

[1] Kappea D,Strominger JL.Human class Ⅱ major histocompatibility complex genes and proteins.Annu Rev Biochem,1998,57:991-1028.

[2] Boss JM.Regulation of transcription of MHC class Ⅱ genes.Curr Opin Immunol,1997,9:107-113.

[3] Tzortzakaki E,Zika E,Spilianakis C,et al.Steroid receptor coactivator 1 links the steroid and interferon gamma response pathways.Mol Endocrinol,2003,17:2509-2518.

[4] Shi B,Vinyals A,Alia P,et al.Differential expression of MHC class Ⅱ molecules in highly metastatic breast cancer cells is mediated by the regulation of the CⅡTA transcription Implication of CⅡTA in tumor and metastasis development.Int J Biochem Cell Biol,2006,38:544-562.

[5] Satoh A,Ikeda H,Toyota M,et al.Epigenetic inactivation of class Ⅱ transactivator (CIITA) is associated with the absence of interferon-gamma-induced HLA-DR expression in colorectal and gastric cancer cells.Oncogene,2004,23:8876-8886.

[6] Kanaseki T,Ikeda H, Takamura Y,et al.Histone deacetylation,but not hypermethylation,modifies class Ⅱ transactivator and MHC class Ⅱ gene expression in squamous cell carcinomas.J Immunol,2003,170:4980-4985.

[7] Reith W,LeibundGut-Landmann S,Waldburger JM.Regulation of MHC class Ⅱ gene expression by the class Ⅱ transactivator.Nat Rev Immunol,2005,5:793-806.

[8] Lu X,Kallinteris NL,Li J,et al.Tumor immunotherapy by converting tumor cells to MHC class Ⅱ positive,Ii protein-negtive phenotype Cancer Immunol.Immunother,2003,52:592-598.

[9] Meazza R,Comes A,Orengo AM,et al.Tumor rejection by gene transfer of the MHC class Ⅱ transactivator in murine mammary adenocarcinoma cells.Eur J Immunol,2003,33:1183-1192.

2011-03-25)

(本文编辑：吕芳萍)

RegulationofMHCclassⅡtransactivatoronMHCclassⅡexpressionofpancreaticcancercelllineCaPanC-2andPanC-02invitro

JIANGJing-xian，ZHANGMin-min，YANGHua，WUHong-yu，ZOUDuo-wu，LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:ZHANGMin-min,Email:minminzhang2002@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of MHC classⅡtransactivator(MHCⅡ TA ) on MHCⅡexpression of human and rat pancreatic cancer cell line CaPanC-2 and PanC-02.MethodsThe recombinant adenovirus (Ad-CⅡTA) was transfected into the CaPanC-2 cell and the PanC-02 cell, then it was cultured for 24, 48, 72 h. The CⅡTA mRNA expressions were assayed by Real Time PCR and CⅡTA protein expressions were determined by Western blotting. The percentage of positive expression cells of MHC Ⅱ were measured by flow cytometry.ResultsThe CⅡTA mRNA expressions of CaPanC-2 cell at 24, 48, 72 h were 16769±6455, 261568±348850 and 834816±97783 folds higher than that of control group (P<0.05). The CⅡTA mRNA expressions of PanC-02 was 548546±87755, 1242684±624888 and 1401647±726145 folds higher than that of control group (P<0.05). CⅡTA protein was not expressed in CaPanC-2 cell and PanC-02 cell. After transfection for 48 h, the CⅡTA protein expressions of CaPanC-2 and PanC-02 were 0.746±0.499 and 0.631±0.244. The percentage of positive expression cells of MHC Ⅱ in CaPanC-2 cells after 24, 48, 72 h were (8.1±0.3)%, (18.9±0.3)%, (78.5±0.90%, which were significantly higher than that in control group [(7.0±0.1)%,P<0.01. The percentage of positive expression cells of MHC Ⅱ in PanC-02 were (5.1±0.2)%, (37.3±2.0)%, (68.8±2.2)%, which were significantly higher than that in control group [(2.2±0.2)%,P<0.01).ConclusionsTransfection of Ad-CⅡTA could increase the expression of CⅡTA and MHC Ⅱ molecules of pancreatic tumor cells in vitro.

Pancreatic neoplasms; Major histocompatibility complex; Adenoviruses; Infection

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.007

国家自然科学基金(30600752)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

张敏敏，Email: minminzhang2002@126.com