菜籽多糖WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响

朱建飞 唐春红 吴谋成

(重庆工商大学环境与生物工程学院1，重庆 400067)

(重庆工商大学绿色食品研究所2，重庆 400067)

(华中农业大学食品科学技术学院3，武汉 430070)

菜籽多糖WPS－1对小鼠腹腔
巨噬细胞免疫功能的影响

朱建飞1，2唐春红1，2吴谋成3

(重庆工商大学环境与生物工程学院1，重庆 400067)

(重庆工商大学绿色食品研究所2，重庆 400067)

(华中农业大学食品科学技术学院3，武汉 430070)

采用MTT法检测细胞的活性，菜籽多糖WPS－1能促进巨噬细胞增殖，并表现出明显的剂量－效果关系，WPS－1促进巨噬细胞增殖的最佳质量浓度为40 μg/mL。采用半定量RT－PCR进一步研究不同作用时间下40 μg/mL WPS－1对腹腔巨噬细胞IL－6、肿瘤坏死因子α(TNF－α)这两种细胞因子以及诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的影响。WPS－1促进腹腔巨噬细胞IL－6、TNF－α和iNOS mRNA表达的最佳时间为24 h。菜籽多糖对巨噬细胞的免疫功能具有调节作用。

菜籽多糖 巨噬细胞 免疫作用

巨噬细胞是机体免疫体系中重要的免疫效应细胞。激活的巨噬细胞是宿主抵抗肿瘤的重要因素，在其中，激活的巨噬细胞分泌IL－1、IL－6、IL－12、TNF－α等细胞因子，这些细胞因子直接参与巨噬细胞介导的杀伤肿瘤细胞的作用［1－3］。激活的巨噬细胞增加iNOS的表达，iNOS催化产生大量的NO，NO是介导巨噬细胞杀伤肿瘤的中心分子［4］。近年来，大量药理及临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能激活免疫受体、提高机体的免疫功能［5］。激活巨噬细胞是其发挥免疫调节作用的重要途径之一［6］。通过研究WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞的影响，检测WPS－1对巨噬细胞增殖活性的作用，并采用RT－PCR法检测了对腹腔巨噬细胞分泌的细胞因子IL－6和TNF－α的影响，同时检测WPS－1在mRNA水平对iNOS的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“双低”品种华杂4号菜籽冷榨粕:湖北华益油料科技公司;巯基乙醇、青霉素、链霉素、脂多糖(LPS)、刀豆球蛋白A(ConA):美国Sigma－Aldrich公司;RPMI－1640细胞培养基:美国Gibco公司;二乙基焦磷酰胺(DEPC)、RNA酶抑制剂(RNasin)、Taq DNA聚合酶:加拿大BBI公司;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料公司提供;Trizol试剂:美国Invitrogen公司;M－MLV逆转录酶:美国MBI公司;Oligo(dT)15、三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)、引物合成:上海生工生物工程技术服务公司;BALB/c雄性小鼠:SPF级，体重(20±2)g，湖北省医学科学院实验动物中心。

SL2300型二氧化碳培养箱:美国Sheldon公司;24孔细胞培养板:美国Corning公司;0.22 μm 微孔滤膜:上海半岛公司净化器材厂;DFC300FX型倒置荧光显微镜:德国Leica公司;UV－9100型紫外可见分光光度计:北京瑞利分析仪器公司;PTC－100型PCR仪:美国MJ公司;JS－300型图像分析系统:上海培清科技公司;ELX 800型全自动酶标分析仪:美国Bio－Tek公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菜籽多糖提取及纯化工艺路线

脱脂菜籽粕，用热水按最佳工艺流程提取［7］。得到的水溶性多糖提取液用筛选出的特1号大孔吸附树脂进行初步纯化［8］，以去除溶液中的游离蛋白及酚类等色素物质。流出液经真空浓缩，再通过分步醇沉以及DE－52纤维素离子交换柱层析工艺［9］，得到菜籽多糖WPS－1，纯度89.3%。

1.2.2 腹腔巨噬细胞的分离

手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械等需经消毒处理;分离巨噬细胞的方法如下［10］:(1)以颈椎脱臼法处死小鼠，用70%乙醇浸湿小鼠全身。将其仰卧放置，四肢展开钉在木板上;(2)在腹股沟区做一横切口，撕裂皮肤以完全暴露腹腔，用70%乙醇冲洗腹壁;(3)用注射器先抽1 mL消毒的空气和4 mL预冷至4℃的培养液，用镊子提起腹壁，从腹部左侧向腹腔中注射;(4)叩打腹壁2 min，使培养液散布于整个腹腔，并促使巨噬细胞从腹腔的浆膜表面释放，形成细胞悬液;(5)另取一支注射器，从腹部右侧进针，抽出悬液，移入预冷的容器中;(6)计数细胞。

1.2.3 巨噬细胞的纯化

根据巨噬细胞黏附能力强、贴壁快的特点，采用差速黏附法纯化巨噬细胞［10］。将密度为 2×106个/mL的细胞悬液接种到培养瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱中培养2～3 h。轻摇培养瓶，倾弃瓶中液体。再用Hanks液清洗2次，除去未贴壁的细胞。加入培养液，镜鉴。瓶中已贴壁的细胞主要是巨噬细胞，纯度可达95%。少量混杂的细胞为淋巴细胞和中性粒细胞，继续培养24 h，换液，除去已变性死亡的中性粒细胞，得到接近纯净的巨噬细胞。

1.2.4 巨噬细胞的接种和培养［10］

将纯化巨噬细胞的培养瓶快速冷冻至2℃，待细胞收缩后猛摇或吹打培养瓶，使细胞从瓶壁上脱落下来。制成细胞悬液，计数并调节细胞密度。以2×105～4×105个/cm2的密度接种细胞。加入适量培养液RPMI1640(20%的胎牛血清)在37℃、5%CO2的饱和水蒸汽培养箱中静息培养2 h后用于试验。

1.2.5 细胞成活率的检测

采用MTT法检测细胞成活率［11］，取24孔细胞培养板，每孔中加入密度为2×105～4×105个/cm2的细胞，加入不同质量浓度的WPS－1的培养液，使WPS －1 的最终质量浓度分别为 1、3、10、30、100 μg/mL，每孔最终体积为500 μL。设空白对照孔(不加任何药物，只有细胞和培养液)。每一质量浓度6个重复孔。置于37℃、5%CO2的饱和水蒸汽培养箱中培养预订时间。弃去培养液上清液，用PBS洗涤细胞两次，每孔加 500 μL 0.5 mg/mL MTT 染液，在37℃、5%CO2的饱和水蒸汽培养箱中继续培养4～6 h。每孔加入 500 μL 含10%SDS(用 10 mmol/L 盐酸配制)的溶液，在37℃、5%CO2的饱和水蒸汽培养箱中继续培养过夜，让结晶物完全溶解，测定570 nm处的OD值。

1.2.6 WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞中细胞因子mRNA表达水平的影响

取6孔细胞培养板，每孔中加入密度为2×105～4×105个/cm2的细胞。根据前期考察WPS－1质量浓度对脾淋巴细胞相关细胞因子mRNA表达的影响，WPS－1质量浓度为40 μg/mL时，各细胞因子mRNA表达接近完全，再增加样品质量浓度，mRNA表达量基本保持不变。因此本文将WPS－1质量浓度固定为40 μg/mL，每孔最终体积为 500 μL，同时以5 μg/mL的LPSConA作为阳性对照。设空白对照孔(不加任何药物，只有细胞和培养液)。每一质量浓度6个重复孔。置于37℃、5%CO2的饱和水蒸汽培养箱中培养预订时间。吸去上清培养液，每孔加入1 mL Trizol试剂，按照Invitrogen公司Trizol试剂说明书提取细胞总的RNA，进行RT－PCR扩增反应，具体操作略。

试验所用细胞因子引物参照文献［12－14］，具体如下:

1.2.7 WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞iNOS的mRNA表达水平的影响检测

应用RT－PCR检测的mRNA表达水平，方法同1.2.6。

IL－6引物的扩增条件为:95℃保温2 min，然后3步循环:95℃变性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行36个循环，最后72℃延伸7 min，样品在4℃中结束反应;TNF－α、iNOS引物的扩增条件为:95℃保温2 min，然后3步循环:95℃变性20 s，61 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共进行 36个循环，最后72℃延伸7 min，样品在4℃中结束反应。

1.2.8 数据处理

使用SAS 8.01软件进行数据分析，数据以X±SD表示，以t检验法进行组间显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞成活率的影响

图1为不同质量浓度WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞的增殖，同空白对照组比，WPS－1为1 μg/mL时，对巨噬细胞增殖无显著影响(P ＞0.05)，5 μg/mL时有显著影响(P ＜0.05)，10～160 μg/mL 范围内有极显著影响(P＜0.01)。WPS－1促进巨噬细胞增殖，表现出明显的剂量－效果关系，巨噬细胞的活性随着WPS－1质量浓度的增加而增加，但到达40 μg/mL后，巨噬细胞的增殖活性趋于稳定。这说明WPS－1作为免疫调节剂的最佳剂量为40 μg/mL。作为阳性对照的LPS和ConA，在5 μg/mL剂量下极显著地促进巨噬细胞的增殖(P＜0.01)，且比WPS－1最高质量浓度组(160 μg/mL)对小鼠总脾淋巴细胞的增殖促进作用大。这说明WPS－1刺激小鼠总脾淋巴细胞发生有丝分裂的能力低于LPS和ConA这两种常用的致有丝分裂原。

图1 WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响

2.2 WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞各细胞因子mRNA表达水平的影响

由图2可得，与空白对照相比，WPS－1与巨噬细胞培养时间为3、6、12 h时，IL－6 mRNA表达量没有显著增加(P＞0.05)，24 h时mRNA表达量有极显著增加(P＜0.01)，且此时mRNA增加量达到最大，但到48 h时mRNA表达量又下降到初始水平，未有显著增加(P＞0.05)。可以得出，WPS－1对腹腔巨噬细胞IL－6 mRNA的表达未表现出时效关系，仅在12～24 h时间范围mRNA表达量突然增加。

图2 WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞IL－6 mRNA表达的影响

由图3可知，与空白对照相比，WPS－1与巨噬细胞培养时间为3、6 h时，TNF－α mRNA表达量没有显著增加(P＞0.05)，培养12 h时mRNA表达量有显著增加(P＜0.05)，24 h时mRNA表达量有极显著增加(P＜0.01)，且此时增加量达到极大值，培养时间延长到48 h时，mRNA表达量迅速减少，但仍表现为极显著增加(P＜0.01)。可以得出，WPS－1可促进腹腔巨噬细胞TNF－α mRNA的表达，有一定的时效关系，给药24 h时表达量最高。

图3 WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞TNF－α mRNA表达的影响

2.3 WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞iNOS的mRNA表达水平的影响

由图4可见，与空白对照相比，WPS－1与巨噬细胞培养时间为3、6、12 h时，iNOS mRNA表达量都没有显著增加(P＞0.05)，仅培养24 h时mRNA表达量表现出极显著增加(P＜0.01)，且此时增加量达到极大值，培养时间延长到48 h时，mRNA表达量又回到初始水平，没有显著增加(P＞0.05)。可以得出，WPS－1可促进腹腔巨噬细胞iNOS mRNA的没有表现出时效关系，但给药24 h时表达量达到最大值。

图4 WPS－1对小鼠腹腔巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响

3 讨论与结论

3.1 WPS－1可促进小鼠腹腔巨噬细胞的增殖，最佳剂量为 40 μg/mL。

3.2 本文研究的两种细胞因子TNF－α和IL－6能直接参与巨噬细胞介导的杀伤肿瘤细胞的作用。TNF－α的抗肿瘤作用机理包括TNF－α的直接作用和诱导的针对肿瘤的免疫应答。用40 μg/mL的WPS－1和巨噬细胞共同培养48 h，在不同的时间点检测IL－6和TNF－α的mRNA表达水平。试验结果显示，在共同培养12 h时，巨噬细胞的TNF－α的mRNA表达水平开始有所增加，因为TNF－α有自分泌效应，即分泌的TNF－α可以诱导巨噬细胞分泌TNF－α，所以当时间延长到24 h，TNF－α的表达进一步明显增加，但是在48 h后，TNF－α的mRNA表达水平下降。IL－6 mRNA表达水平的增加时间出现较晚，应该不是WPS－1直接的对 IL－6的增加作用，可能是 TNF－α对其产生影响，因为TNF－α能促进巨噬细胞分泌IL－6。但是同时产生的IL－6反过来又会抑制巨噬细胞产生TNF－α。检测WPS－1处理的巨噬细胞内iNOS的mRNA表达水平，发现在共同培养24 h后，iNOS的mRNA表达才增加，由此可见iNOS的mRNA的增加并非WPS－1的直接诱导作用。促使iNOS的mRNA表达增加可能的原因是，由于WPS－1可以诱导巨噬细胞产生TNF－α，巨噬细胞产生的TNF－α又反过来促进巨噬细胞iNOS基因的表达，从而产生NO。

3.3 WPS－1可提高小鼠巨噬细胞的活性，从而增加IL－6和TNF－α这两种细胞因子以及iNOS的分泌量。

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Immunomodulating Effects of Rapeseed Polysaccharide WPS－1 on Mouse Peritoneal Macrophage

Zhu Jianfei1，2Tang Chunhong1，2Wu Moucheng3
(College of Environmental and Biological Engineering，Chongqing Technology and Business University1，Chongqing 400067)
(Natural and Health Food Research Institute，Chongqing Technology and Business University2，Chongqing 400067)
(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University3，Wuhan 430070)

The MTT assay was adopted to measure cell activation.Rapeseed polysaccharide WPS －1 promoted proliferation macrophage cells in a dose－ dependent manner.The optimal concentration of WPS －1 to promote proliferation was 40 μg/mL.Semi－ quantitative RT － PCR was performed to determine changes in cytokine mRNA expression.The influence of WPS－1 to IL －6，tumor necrosis factor－ α (TNF － α)，and inducible nitric oxide synthase(iNOS)mRNA expression were all 40 μg/mL.The best time of WPS －1 to promote IL －6，TNF － α，iNOS mRNA of expression were all 24 h.The results indicated that rapeseed polysaccharide could enhance the immune regulation of peritoneal macrophages.

rapeseed polysaccharide，macrophage，immunomodulating effects

TS229

A

1003－0174(2011)08－0041－05

“十五”国家重大科技专项(200lBA501 A20)，“十一五”湖北省重大科技攻关项目(2006AA 20lB32)

2010－10－25

朱建飞，男，1979年出生，讲师，博士，食品科学与工程