佛手挥发油对B16黑色素瘤细胞体外增殖的抑制作用

吕学维 邵邻相 张均平 麻艳芳 邓 刚 徐玲玲 李 美

(浙江师范大学化学与生命科学学院，金华 321004)

佛手挥发油对B16黑色素瘤细胞体外增殖的抑制作用

吕学维 邵邻相 张均平 麻艳芳 邓 刚 徐玲玲 李 美

(浙江师范大学化学与生命科学学院，金华 321004)

利用水蒸气蒸馏法提取佛手挥发油，MTT法测定细胞活力;倒置显微镜，Hoechst 33342/PI荧光染色及扫描电镜观察细胞凋亡与坏死的形态变化;彗星电泳法检测细胞DNA损伤程度。结果表明:佛手挥发油能够显著抑制B16黑色素瘤细胞增殖(P＜0.05)，呈剂量依赖效应;佛手挥发油处理B16黑色素瘤细胞6 h后，倒置显微镜下观察到低、中剂量组(62.5、125、250 μg/mL)细胞体积缩小，形态变得不规则，细胞碎片增多，部分细胞成团生长，而高剂量组(500 μg/mL)细胞膜崩解，胞浆外溢，细胞碎片增多;荧光显微镜下可见低、中剂量组细胞核固缩，核染色质凝集，边缘化等典型细胞凋亡特征，而高剂量组细胞核为PI染成红色，核染色质分布均匀，呈细胞坏死特征;扫描电镜观察到试验组细胞形态不规则，细胞表面不平整，微绒毛减少等细胞形态变化;彗星电泳试验结果显示:低、中剂量组细胞彗星头逐渐减小，彗尾较长且近似呈圆形，而高剂量组细胞彗星头较大，尾部相对较短。

佛手 挥发油 抑制作用 细胞凋亡 坏死

佛手(fingered citron)，又名佛手柑，为芸香科植物佛手(Citrus medica L.var.sarcodactylis.Swingle)的成熟果实。各种芸香科植物都含有芳香气味的挥发油，佛手的挥发油含量较高，可作为香料植物，应用于食品与化妆品中。郭卫东等［1］的研究结果表明佛手鲜果挥发油对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母菌生长均具有较明显的抑制作用。Hata T等［2］研究表明，芸香科柑橘属植物葡萄柚挥发油能够诱导人白血病HL－60细胞凋亡，其挥发油主要成分为柠檬烯。现代药理学研究表明，植物挥发油具有广泛的药理活性，可有效抑制肝癌、子宫颈癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、人白血病细胞，人卵巢癌细胞等多种癌细胞增殖，为一类具有开发价值的抗肿瘤中药［3－7］。但有关佛手挥发油抗肿瘤的研究国内外还鲜见报道。本研究以金华佛手果挥发油为受试药物，其主要化学成分之一为柠檬烯［8］，以小鼠B16黑色素瘤细胞为靶细胞，研究佛手挥发油对B16细胞增殖的影响，并应用细胞生物学方法对佛手挥发油诱导B16细胞凋亡的特点进行初步探讨，为佛手资源的开发和利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和药物

细胞:小鼠B16黑色素瘤细胞株购于中国科学院上海细胞生物研究所。

佛手挥发油:金华佛手果实洗净后切块，机械匀浆，水蒸气回流装置提取挥发油，无水硫酸钠干燥，过滤灭菌后称200 mg挥发油，溶解于20 μL无菌吐温－80，涡旋振荡混匀，加入磷酸盐缓冲液(PBS)至2 mL，涡旋振荡混匀，4℃避光保存。

1.2 主要试剂与仪器

RPMI1640培养基、胰蛋白酶:美国Gibco BRL公司;新生牛血清:杭州四季青生物工程材料公司;二甲基亚砜(DMSO)、四氮唑蓝(MTT)、溴化乙锭(EB)、Hoechst 33342、碘化丙啶(PI)、吐温 －80:Sigma公司;琼脂糖:加拿大BBI公司。

3111型CO2细胞培养箱、1500型全自动酶联免疫检测仪:美国Thermo Electron公司;TS－100型倒置显微镜、E600型荧光显微镜:日本Nikon公司;AB－104N型电子分析天平:瑞士 Mettler公司产品;KYKY－1000B型扫描电子显微镜:中国中科院科学仪器厂。

1.3 细胞培养和药物处理

细胞采用含10%新生牛血清的1640培养基(100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)，置于37 ℃含5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞贴壁生长，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA(体积比1∶1)消化传代，取对数增殖期的细胞用于试验。

2×103细胞/孔细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，3×103细胞/孔细胞悬液接种于放有盖玻片的6孔细胞培养板中，常规培养24 h后加入药物，使其终浓度为 62.5、125、250、500 μg/mL，空白对照组加等体积无血清1640培养基，并设置0.005%吐温－80作为对照，药物作用6 h后进行各项指标检测。

1.4 MTT法测定细胞活力

96孔细胞培养板每孔加MTT溶液10 μL，孵育4 h 后，加入 DMSO 150 μL，振荡15 min，全自动酶联免疫检测仪570 nm波长下测定吸光度(OD)值，计算平均值和标准差。用SPSS13.0软件求半数杀伤浓度(IC50)，按下列公式计算被测药物对癌细胞生长的抑制率。

抑制率=(对照组OD值－试验组OD值)/对照组OD值×100%

1.5 倒置显微镜观察细胞形态变化

药物作用6 h后，对照组B16细胞和佛手挥发油处理组细胞直接置于倒置显微镜下观察拍照。

1.6 Hoechst 33342/PI荧光染色法观察细胞核DNA

取出细胞爬片，加入Hoechst33342染液(5 μg/mL)和PI染液(50 μg/mL)避光染色30 min，紫外光激发，荧光显微镜下观察拍照。

1.7 扫描电镜观察细胞表面超微结构

2.5 %的戊二醛固定，PBS清洗后梯度乙醇脱水处理，醋酸异戊酯置换。HCP－2型CO2临界点干燥仪中干燥处理，SBC－2型离子溅射仪中真空镀金。KYKY－1000B型扫描电子显微镜下观察细胞表面超微结构变化。

1.8 彗星电泳检测细胞核DNA损伤

主要根据罗明志等［9］的方法进行试验。收集各组细胞，经灌胶、裂解、解旋、电泳、中和、脱水和染色，荧光显微镜下观察拍照。

1.9 统计方法

数据以 x－±s表示，采用 SPSS 13.0统计软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 佛手挥发油对B16细胞增殖的影响

MTT法检测结果显示，佛手挥发油对B16细胞具有较强的细胞毒作用。随着药物浓度的增加，抑制作用增强，呈良好的量效关系。IC50值为(138.000±0.005)μg/mL(表1)。

表1 佛手挥发油对B16黑色素瘤细胞活力的影响(x－±s，n=15)

2.2 佛手挥发油对B16细胞形态的影响

2.2.1 倒置显微镜观察结果

倒置显微镜下观察发现，对照组与0.005%吐温－80组B16细胞分布均匀，分裂旺盛，细胞伸展，多呈梭形或不规则多角形，贴壁牢固，生长旺盛(图1a，图1b);用终质量浓度为 62.5、125、250 μg/mL 的佛手挥发油处理B16细胞6 h后，可见随着药物浓度的增加，细胞数目逐渐减少，细胞成团生长，部分细胞体积缩小，形态变得不规则，细胞碎片增多(图1c～图1e);500 μg/mL的佛手挥发油处理组，B16细胞胞膜完整性破坏，细胞内含物外泄，细胞已坏死 (图1f)。

图1 倒置显微镜观察不同浓度佛手挥发油作用B16细胞6 h后细胞的形态学变化(×200，Bar=20 μm)

2.2.2 Hoechst 33342/PI荧光染色观察细胞核变化Hoechst 33342是一种DNA亲和染料，能够透过细胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出淡蓝色荧光。PI能透过细胞膜损伤的细胞，与核DNA结合，发橘红色荧光。在荧光显微镜下观察，正常细胞核呈现均匀的蓝色荧光(图2 a，图2b)。不同浓度佛手挥发油处理B16细胞6 h后，荧光显微镜下观察，62.5、125、250 μg/mL 佛手挥发油处理组细胞核染色质凝聚，边缘化，核皱缩，细胞核内出现致密的块状或颗粒状荧光，多数细胞核碎裂，表现为细胞凋亡特征(图2c～图2e)。500 μg/mL佛手挥发油处理B16细胞后，细胞核呈弱红色荧光，核染色质分布均匀，说明细胞已经坏死(图2 f)。

图2 Hoechst 33342/PI荧光染色观察细胞核形态变化(×250，Bar=40 μm)

2.2.3 扫描电镜观察佛手细胞表面超微结构变化

正常对照组与0.005%吐温－80组细胞多数呈长梭形，大且饱满，表面覆有丰富的微绒毛，细胞生长旺盛;药物作用 6 h 后，62.5、125 μg/mL 佛手挥发油处理组部分细胞收缩，变圆，细胞表面不平整，微绒毛减少，细胞形态不规则(图3 c，图3d);250 μg/mL佛手挥发油处理组B16细胞皱缩为近似圆球形，细胞膜表面有泡状突起(图3e);500 μg/mL佛手挥发油处理B16细胞6 h后，细胞膜崩解，表面微绒毛消失，细胞内含物外泄，细胞已坏死(图3f)。

图3 扫描电镜观察佛手挥发油对B16细胞表面超微结构的影响(×2 000，Bar=10 μm)

2.3 彗星电泳检测细胞DNA损伤结果

彗星电泳，又名单细胞凝胶电泳，是一种在单细胞水平上检测DNA损伤的微电泳技术。无DNA断裂的细胞核呈圆形，荧光强度均匀;有DNA损伤的细胞核在电场作用下DNA碎片向阳极迁移，形成“彗星”样拖尾，DNA损伤越重，碎片越多，彗尾越长。

图4 彗星电泳法检测细胞DNA损伤(×200，Bar=50 μm)

从图4可以看出，对照组与0.005%吐温－80组细胞核结构完整且着色均匀，无彗尾形成，说明细胞DNA 未损伤(图4 a，图4b);62.5、125、250 μg/mL 佛手挥发油处理B16细胞6 h后，受损伤的DNA泳出，形成近似圆形的彗星尾形状，随着药物作用浓度的增加，彗星头逐渐缩小(图4 c～图4e)，说明DNA损伤越来越严重，细胞已发生凋亡。500 μg/mL佛手油处理组，细胞的彗星头较大，彗尾相对较短(图4 f)，细胞已坏死。团生长，细胞形态不规则;Hoechst 33342/PI染色荧光显微镜下观察可见，低中剂量(62.5、125、250 μg/mL)的佛手挥发油处理B16细胞6 h后，细胞核固缩，核染色质凝聚、边缘化，出现块状或颗粒状荧光，与文献中报道的细胞凋亡特征一致［10］，而高剂量(500 μg/mL)佛手挥发油处理B16细胞6 h后，细胞核为PI染成弱红色，核染色质分布均匀，表现为细胞坏死特征;扫描电镜观察发现低中剂量佛手挥发油处理组B16细胞固缩，细胞形态不规则，表面微绒毛减少等特征，以上形态特征与豆长明等［11］所描述的细胞凋亡状态一致，而高剂量佛手挥发油处理组B16细胞出现了明显的细胞坏死特征，如:细胞膜崩解，胞质外泄，细胞核形态正常。另外，通过彗星电泳试验进一步证实了以上试验结果。采用不同浓度的佛手挥发油处理B16细胞6 h后，彗星电泳结果显示，低剂量组B16细胞形成头小，尾长的彗星形态，而高剂量组B16细胞彗星头较大，彗尾较短，与文献中报道的典型凋亡与坏死彗星形态相一致［12］。

综上所述，佛手挥发油可有效杀伤体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞，低中剂量的佛手挥发油可诱导细胞凋亡，高剂量的佛手挥发油可致细胞坏死。

3 讨论与结论

细胞凋亡与坏死是细胞死亡的两种主要方式，细胞凋亡时表现为细胞萎缩、核染色质凝集边缘化、细胞膜完整和产生凋亡小体等特征;细胞坏死时表现为细胞膜破损、细胞核溶解内容物外泄、出现细胞碎片等特征。目前检测细胞凋亡与坏死的方法很多，但形态学检测仍是确定细胞凋亡与坏死的最可靠的方法。

本试验采用不同浓度的佛手挥发油作用小鼠B16黑色素瘤细胞，MTT法检测佛手挥发油对B16细胞的毒性，结果表明62.5 μg/mL的佛手挥发油即可显著抑制B16细胞增殖，并随佛手挥发油作用浓度的升高，抑制作用增强，存在剂量依赖效应，由此可见，佛手挥发油在体外对B16细胞有直接杀伤作用。倒置显微镜下观察发现细胞数目逐步减少，成

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Inhibitory Effect of Fingered Citron Essential Oil on Proliferation of B16 Melanoma Cells in Vitro

Lü Xuewei Shao Linxiang Zhang Junping Ma Yanfang Deng Gang Xu Lingling Li Mei
(College of Chemistry and Life Science Zhejiang Normal University，Jinhua 321004)

The essential oil from fingered citron was extracted by steam distillation to determine the cell activity by the MTT method;the inverted microscope and the Hoechst 33342/PI fluorescent staining and scanning electron microscopy were used to observe the morphological changes of apoptosis and putrescence;DNA damage was detected by comet assay.The results showed that the volatile oil of fingered citron could obviously inhibit the cell proliferation of B16 melanoma(P ＜0.05)，which was subject to the dose;after the treatment(6 h)of B16 melanoma with the volatile oil of fingered citron，it was observed under the invested microscope that the cell body of the low －medium dose group(62.5，125 and 250 μg/mL)reduced，the morphological change was irregular，the cell debris increases and some cells grew in bulk，while the high dose group(500 μg/mL)showed morphological changes including ruptured membranes，cytoplasm spillover and increased fragments.With a fluorescence microscope，it could be seen that the low－ medium dose group presented nucleus pycnosis，nuclear chromatin concentration，peripherization and other typical apoptosis characteristics，while the high dose group showed PI tinged red of nucleus，uniform distribution of nuclear chromatin and characteristics of cytoclasis;under the scanning electron microscope，it was observed that t he cellular morphology of the test group was irregular，cell surfaces were uneven，the microvillus reduced and other changes were found in cellular morphology.Moreover，the test results of the comet assay showed that in the low or middle dose groups，comet heads were smaller and comet tails were longer，compared with those in the high dose group.

fingered citron，essential oil，inhibitory effect，apoptosis，necrosis

R285.5

A

1003－0174(2011)08－0050－05

2010－11－05

吕学维，男，1982年出生，硕士，细胞生物学

邵邻相，男，1962年出生，教授，硕士生导师，细胞生物学、营养学