寇氏隐甲藻不同破壁方法的研究

姜剑锋 赵丽芹 陈 涛 何东平

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院1，呼和浩特 010018)

(湖北百信食品有限公司研发中心2，武汉 430040)

(中国科学院武汉病毒研究所3，武汉430071)

(武汉工业学院食品科学与工程学院4，武汉 430023)

寇氏隐甲藻不同破壁方法的研究

姜剑锋1，2，4赵丽芹1陈 涛2，3何东平2，4

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院1，呼和浩特 010018)

(湖北百信食品有限公司研发中心2，武汉 430040)

(中国科学院武汉病毒研究所3，武汉430071)

(武汉工业学院食品科学与工程学院4，武汉 430023)

寇氏隐甲藻是海洋微藻的一种，在寇氏隐甲藻的细胞油脂中，二十二碳六烯酸的含量高达30%～50%。但长期以来，因为微藻的细胞壁很难破碎，导致油脂的提取率不高。运用超声波法、生物酶法，反复冻溶法等方法，对寇氏隐甲藻进行了破壁研究。结果表明，这些方法都对寇氏隐甲藻都具有一定的破壁作用，破壁后油脂的提取率也有了不同程度的提高，把酶法破壁和超声波法破壁结合起来，在酶解5 h后，再超声波1 h，破壁率可高达91.7%，油脂提取率提高了21.7%，破壁效果更为理想。

寇氏隐甲藻 二十二碳六烯酸 破壁

二十二碳六烯酸(英文名Docosahexaenoic acid，简称 DHA，下同)，化学名称为二十二碳 －4，7，10，13，16，19 －六烯酸(全顺式)，简记为 C22:6(n －3)，属n－3系列长链多不饱和脂肪酸［1－2］。DHA 是一种功能性脂肪酸，它是人体大脑细胞的重要组成成分，占大脑脂肪酸的25% ～33%，在胎儿及婴幼儿大脑和视觉系统发育过程中占有十分重要的地位，还能有效防止老年痴呆症，被称为“高智商因子”、“脑黄金”［3－5］。此外，DHA 还具有加速骨骼增长，防止骨质疏松;减少神经衰弱及抑郁症的发生;降低心肌梗塞、动脉硬化、高血压等心血管疾病发生的概率的功能;甚至具有抗癌作用，可促进成年人外周血液单核细胞的增殖，提高机体免疫力，抑制肿瘤细胞的增生。因此，DHA在婴幼儿配方乳粉和配方食品、功能性饮料、食用油脂及其它方面都有着广泛的应用［1，6－9］。

目前，DHA的来源主要有2种:深海鱼油加工产品和微生物油脂。但由于深海鱼油脂肪酸组成复杂，造成纯化工艺复杂和产品得率低下，且鱼油中高的EPA含量和鱼腥味也限制了它的应用范围。而通过微生物发酵产生的富含DHA的油脂，则较好的解决了上述问题［10］。

寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)是海洋微藻的一种，可在没有光照的条件下发酵培养，从而实现细胞的增长和油脂的积累。在寇氏隐甲藻藻体中，含油脂高达30% ～40%，而DHA可占总脂肪酸的30%～50%左右［11］。但长期以来，因为微藻的细胞壁很难破碎，油脂难以溶出，导致提取率不高。本试验通过对各种破壁方法的研究，找到了一种较为理想的破壁方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

寇氏隐甲藻:实验室保藏;培养基:自制;纤维素酶(酶活:10～140万U/g)、中性蛋白酶(酶活:20万U/g)、碱性蛋白酶(酶活:20万U/g)、木瓜蛋白酶(酶活:20万U/g)和糖化酶(酶活:20万U/g):南宁庞博生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX－150C型恒温恒湿箱:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;SW－CJ－1F型净化工作台:苏州净化设备有限公司;HYQ－150S型全温摇床:武汉汇诚生物科技有限公司;TDL－5A型台式低速离心机:上海菲恰尔分析仪器有限公司;血球计数板:上海市求精生化仪器有限公司;BM100型光学显微镜:南京江南永新光学有限公司;DF－1型数显集热式磁力搅拌器:常州国华电器有限公司;KQ2200DB型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;AUY120型电子天平:岛津国际贸易(上海)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 寇氏隐甲藻的培养

从平板上取一定量的寇氏隐甲藻藻种于一级种子培养基，置于摇床上，28℃、150 r/min培养48 h;再按20%的接种量转接到二级种子培养基，28℃、160 r/min培养48 h;然后按10%的接种量接种到发酵培养基中，26℃、180 r/min培养7 d。离心收集新鲜寇氏隐甲藻藻泥，然后加入一定量的无菌水，制成浓缩液，冷藏备用。

1.3.2 冻溶法

利用温差破壁是一种常用的破壁方法，它是利用淬冷和急热过程中产生的冲击热应力使细胞壁破裂。在淬冷过程中，细胞壁的外表面随着温度的下降而收缩，但此时内部还是热的，故细胞壁收缩受到约束而产生了拉伸应力，内表面则相反，受压缩应力作用;在升温解冻时，细胞壁外表面由于膨胀受到约束产生压缩应力，而内表面则产生拉伸应力。这种交变热应力作用最终导致细胞壁的破裂［12］。

取20 mL浓缩液，置于－18℃冰柜中冷冻24 h，取出后迅速置于80℃的水浴中使之迅速解冻。由于单独一次的冷冻和解冻破壁率可能并不高，本试验进行一天一个循环，测量每次循环后的破壁率。

1.3.3 超声波法

取20 mL浓缩液，稀释至200 mL，超声时温度55℃、功率90%，每20 min计算1次破壁率。

1.3.4 酶法破壁

1.3.4.1 单一酶处理

取20 mL浓缩液，稀释至200 mL，分别用纤维素酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、糖化酶，按1%的添加量，在各自最适宜的条件下，进行其对微藻破壁效果的研究，每隔1 h计算破壁率［13］。

1.3.4.2 复合酶处理

将破壁效果较好的碱性蛋白酶作为主酶，分别以纤维素酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、糖化酶作为辅酶，选择合适的酶解条件，进行复合酶实验，用酶总量仍为1%。复合酶组合如下:A:0.8%碱性蛋白酶+0.2%纤维素酶;B:0.8%碱性蛋白酶+0.2%糖化酶;C:0.8%碱性蛋白酶 +0.2%木瓜蛋白酶;D:0.8%碱性蛋白酶+0.2%中性蛋白酶;E:0.8%碱性蛋白酶+0.1%纤维素酶+0.1%糖化酶;F:0.8%碱性蛋白酶+0.1%中性蛋白酶+0.1%木瓜蛋白酶。具体试验过程参照单一酶的方法。

1.3.5 破壁率的计算

细胞计数法:利用显微镜，通过血球计数板计算出反应前后细胞数即可。

破壁率=(1－n/n0)×100%

式中:n为破壁后的细胞数，n0为原始细胞数。

2 结果与讨论

在利用血球计数的时候，观察到的寇氏隐甲藻细胞如图1所示，计数时，诸如形如A类细胞基本保持完整，记为一个;形如B类细胞正处于破壁阶段，记为半个;形如C类细胞基本破壁完成，不计数。以此标准来计算破壁率。

图1 寇氏隐甲藻细胞图示

2.1 寇氏隐甲藻培养结果

经活化、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养后，共得5 L发酵液;离心收集后的藻泥，加入一定量的无菌水，搅拌使藻体分散，制成1 L浓缩液。镜检浓缩液发现，藻体基本以单个的形式存在且无破壁现象，符合试验用要求。

2.2 冻溶对寇氏隐甲藻破壁的作用

反复的冻溶对寇氏隐甲藻的破壁效果如图2所示。

图2 反复冻溶对寇氏隐甲藻破壁率的影响

由图2可知，随着反复冻溶次数的增加，寇氏隐甲藻的破壁率增大，2次处理后破壁率就达到高达50%。尽管反复冻溶对寇氏隐甲藻的破壁效果较好，但由于在试验过程中，发现高温会引起藻细胞和藻油的一些变化，且高耗能，生产上应用前景不被看好。

2.3 不同种类的酶对寇氏隐甲藻破壁的作用

分别用纤维素酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、糖化酶，对寇氏隐甲藻的破壁效果如图3所示。

图3 单一酶对寇氏隐甲藻破壁率的影响

从图3中可知，在5种酶单独使用时，对寇氏隐甲藻破壁率的影响存在明显的差异，其中以碱性蛋白酶的破壁效果最好，破壁率高达80.3%;而纤维素酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、糖化酶破壁率较低，均不超过40%。在试验中，随着时间的推移，破壁率会增大，但在加入碱性蛋白酶约5 h、其他各种酶3 h后，破壁率基本不变。在实际生产应用中，考虑到生产成本的因素，如果加入碱性蛋白酶，则酶解时间5 h为佳。

2.4 复合酶对寇氏隐甲藻破壁的作用

各种复合酶组合的处理对寇氏隐甲藻破壁的作用如图4所示。

图4 复合酶对寇氏隐甲藻的破壁率的影响

从图4中可知，所用复合酶组合的效果低于单一碱性蛋白酶，原因可能是酶与酶之间存在相互作用，使其活性降低;也可能是不同的酶最适pH、最适温度等不一样的缘故。鉴于采用复合酶法破壁效果较差，不再考虑复合酶的使用。

2.5 超声波对寇氏隐甲藻破壁率的影响

超声波对寇氏隐甲藻的破壁作用如图5所示。

图5 超声波对寇氏隐甲藻破壁率的影响

由图5可知，超声波对寇氏隐甲藻的破壁效果较好，时间短、破壁率较高，2 h后破壁率就接近60%，3 h以后破壁率上升幅度不大。

3 结论

运用冻溶法、超声波法、单一碱性蛋白酶法和复合酶法都对寇氏隐甲藻有较好的破壁效果。但由于反复冻溶法涉及的高温，可能会带来藻体和藻油一些不良的变化，且反复的淬冷－急热过程会消耗大量的能量，生产上不建议使用。酶法破壁条件温和、耗能少、工艺简单、易于操作，既可达到良好的破壁效果，又可以避免高温和能耗，且不需要额外的设备，适合工业化生产，应用前途较好。超声波法时间较短，有条件的企业也可以运用。另外，把酶法破壁和超声波法破壁结合起来，在酶解5 h后，再超声波1 h，破壁率可高达 91.7%，油脂提取率提高了21.7%，破壁效果更为理想。

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Study on Different Wall－broken Methods for Crypthecodinium Cohnii

Jiang Jianfeng1，2，4Zhao Liqin1Chen Tao2，3He Dongping2，4
(College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University1，Hohhot010018)
(Investigation Center，Hubei Pashun Foods Co.，Ltd.2，Wuhan 430040)
(Wuhan Institute of Virology，Chinese Academy of Science3，Wuhan 430071)
(College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University4，Wuhan 430023)

Crypthecodinium cohnii is a marine microalgae，and the DHA contents are as high as 30%to 50%in the Crypthecodinium cohnii cell oils.But for a long range，oil extraction rate was unsatisfactory since cell walls were hard to break.The breaking of cell wall of Crypthecodinium cohnii by supersonic treatment，enzymatic procession and temperature－difference was evaluated separately in the article.The results showed that all methods were effective to the wall－ broken efficiency and oil extraction rate.The better results could be obtained if we combined the enzymatic procession(for 5 h，first)and the supersonic treatment(for 1 h，then)，as the rate of wall broken could be up to 91.7%and the oil extraction rate increased 21.7%.

Crypthecodinium cohnii，Docosahexaenoic acid(DHA)，Wall－ breaking

Q178.53

A

1003－0174(2011)08－0092－04

2010－10－28

姜剑锋，男，1985年出生，硕士，农产品加工及贮藏工程

何东平，男，1957年出生，教授，博士生导师，微生物油脂与植物蛋白