山核桃外果皮总酚的微波辅助提取工艺优化及其抗氧化研究

吴峰华 罗自生 何志平 庞林江

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院1，杭州 310029)

(浙江农林大学农业与食品科学学院2，临安 311300)

山核桃外果皮总酚的微波辅助提取工艺优化及其抗氧化研究

吴峰华1，2罗自生1何志平2庞林江2

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院1，杭州 310029)

(浙江农林大学农业与食品科学学院2，临安 311300)

在单因素试验的基础上以乙醇浓度、液料比和微波功率为试验因素，以总酚得率为响应值，采用三因素三水平的响应面分析法进行试验。并通过还原力、DPPH清除能力和β胡萝卜素亚油酸三个体系来评价提取物的抗氧化能力。结果表明，山核桃外果皮中总酚提取的最佳工艺条件为:乙醇体积分数56.0%，料液比1∶50，微波功率502.4 W提取时间100 s;实际测得总酚得率为123.41 mg/g，与模型预测值基本相符。山核桃外果皮提取物有很强的抗氧化活性，清除DPPH自由基的能力与BHT相当。

山核桃外果皮 总酚 提取 响应面 抗氧化

近年来天然抗氧化剂的研究备受关注，其中多酚类是主要的抗氧化活性成分之一。研究表明，酚类物质能有效降低或者抑制由于氧化作用引起的心血管疾病、癌症和衰老性疾病等多种慢性病［1－2］;同时对食品的保鲜也有积极的作用［3］。山核桃(Carya cathayensis)属胡桃科山核桃属木本植物，主要分布于浙、皖两省交界的天目山区周围，是浙江省乃至世界性特色干果。在利用完山核桃之后，外果皮基本属于废弃物，没有得到充分利用，并且还造成了环境污染。通过对该属植物果皮化学成分的研究，发现其含有黄酮类、萜类、萘醌及其苷、多酚、有机酸等多种成分［4］，具有开发成为植物源抗氧化剂、杀菌剂的潜力。目前对山核桃外果皮的研究主要集中在化学成分鉴定，提取物活体抑菌活性研究，黄酮提取条件的研究等方面，而对果皮总酚提取及其抗氧化研究鲜有报道［5－7］。采用微波辅助法提取山核桃外果皮中的总酚物质，并通过响应曲面法试验设计优化提取工艺，同时通过还原力、DPPH清除能力和β-胡萝卜素亚油酸3个体系评价提取物的抗氧化活性，以期为山核桃外果皮的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山核桃外果皮:9月上旬采自浙江临安昌化山区。

福林酚试剂(Folin－Ciocalteus'reagent)、1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH)、β－胡萝卜素:Sigma公司;其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 微波辅助提取工艺流程

山核桃外果皮原料→45℃恒温干燥72 h→粉碎后过60目筛→山核桃外果皮粉末→加入一定量的乙醇溶液→微波辅助提取→抽滤→定容→总酚提取液

1.2.2 总酚含量测定

1.2.2.1 标准曲线的建立

对Lim等［8］报道的方法稍加改动:吸取质量浓度分别为 0、20、40、60、80、100、200 和 300 μg/mL 的没食子酸标准溶液0.6 mL于10 mL的比色管中，加入稀释10倍的福林酚试剂3 mL，然后加入7.5%碳酸钠溶液2.4 mL，混匀，黑暗中放置30 min，在波长765 nm测定吸光值，绘制标准曲线:Y=0.010 4X+0.008 1，R2=0.999 3。

1.2.2.2 提取液中总酚含量的测定

取不同试验条件下各组提取液，稀释适当的倍数，按照上述方法显色，测定吸光值。将吸光度值代入标准曲线方程计算样品中总酚含量。结果以每克山核桃外果皮粉末中含有相当没食子酸的质量表示，即 mg/g。

1.2.3 单因素试验

称取一定量的山核桃外果皮粉末，研究乙醇浓度、微波功率、液料比和微波处理时间对山核桃外果皮总酚提取率的影响。

1.2.4 山核桃外果皮提取物抗氧化特性测定

按照优化后的最佳工艺提取山核桃外果皮总酚，将提取液减压浓缩并真空冻干后配置成不同浓度的样品溶液进行抗氧化活性测定，通过FC法测定提取物粉末中总酚含量为17.45%。

1.2.4.1 还原力的测定

还原力的测定参照Apati等［9］所报道的方法。分别吸取质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.3 和0.4 mg/ml的提取物溶液1 ml，依次加入 0.5 mol/L(pH 6.6)的磷酸盐缓冲液 2.5 mL和 1%铁氰化钾溶液(K3Fe(CN)6)2.5 mL，于50℃水浴中保温20 min，取出冷却后，再加入10%三氯乙酸溶液(TCA)2.5 mL，以3 000 r/min的转速离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸馏水，0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，充分混匀，静置10 min后，在700 nm下测定其吸光度值，同时用BHT作对比试验。还原力的IC50定义为:吸光值为0.5时样品的浓度［10］。浓度越小，还原力越强。

1.2.4.2 DPPH 自由基清除率

山核桃外果皮提取物清除DPPH自由基能力的测定参照Hatano等［11］的方法。分别取0.3 mL质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.3 和 0.4 mg/mL 提取物溶液，与2.7 mL DPPH甲醇溶液(0.1 mmol/L)混合，充分混匀后在室温下静置2 h，在517 nm测吸光值A1，空白以提取剂代替样品测得A0，同时以BHT作对比试验。

1.2.4.3 抗油脂氧化作用的测定

利用β－胡萝卜素的褪色程度来评价山核桃外果皮提取物抗油脂氧化作用，测定方法参照Shahsavari等［12］的方法稍加调整。称取40 mg亚油酸和400 mg吐温40于烧瓶内，再加入3 mL β－胡萝卜素溶液(5mg β－胡萝卜素溶解于50mL氯仿)，摇匀。在35℃下，真空旋转除去氯仿，加入100 mL重蒸水，混匀，得到β－胡萝卜素亚油酸乳化液。

取0.2 mL不同质量浓度的山核桃外果皮提取物溶液，加入上述配置好的乳化液4 mL，摇匀，将盛有上述溶液的比色管放置在50℃水浴锅中。2 h后，在470 nm下，测定吸光值Asample。用不加β－胡萝卜素的亚油酸乳化液作空白，不加提取物溶液的亚油酸乳化液作对照Acontol。同时以BHT作对比试验。山核桃外果皮提取物的抗氧化活性(Antioxidant activity，简称AA)可以通过β－胡萝卜素颜色变化(即吸光值)进行计算，公式如下:

式中:Asample(2h)与Acontol(2h)为试样和对照样2 h后的吸光值，Acontol(0h)为对照样在保温初始时(t=0)的吸光值。

1.2.5 统计分析

所有试验数据为3次重复试验结果的平均值。采用SPSS 13.0软件处理数据，并用ANOVA进行邓肯氏多重差异分析(取P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 山核桃外果皮总酚提取单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对总酚得率的影响

准确称取2.00 g的山核桃外果皮干粉，按料液比 1∶30(g/mL)分别加入体积分数为 0、20、40、60、80和100%的乙醇，在微波功率为640 W条件下提取60 s，抽滤，定容，计算总酚得率，试验结果见图1。结果显示，40%和60%乙醇提取山核桃外果皮总酚得率无显著差异，考虑经济因素，选取乙醇体积分数为40%。

图1 乙醇浓度对总酚得率的影响

2.1.2 料液比对总酚得率的影响

准确称取 6.00、3.00、2.00、1.50、1.20 和 1 g山核桃外果皮干粉，分别加入40%乙醇60 mL，在微波功率为640 W条件下提取60 s，抽滤，定容，计算多酚得率，试验结果见图2。结果显示，随着料液比的增大，山核桃外果皮总酚溶出率也增大，当料液比大于1∶50时，总酚得率变化不大，综合经济因素考虑确定料液比单因素最佳条件为1∶50。

图2 料液比对总酚得率的影响

2.1.3 微波功率对总酚得率的影响

准确称取2.00 g的山核桃外果皮干粉，按料液比1∶30(g/mL)加入40%乙醇，分别在微波功率0、160、320、480、640 和 800 W 条件下提取 60 s，抽滤，定容，计算多酚得率，试验结果见图3。结果显示，微波功率在480 W时山核桃总酚得率最高。

图3 微波功率对总酚得率的影响

2.1.4 微波时间对总酚得率的影响

准确称取2.00 g的山核桃外果皮干粉，按料液比1∶30(g/mL)加入40%乙醇，在微波功率640 W条件下，分别提取 20、40、60、80、100 和 120 s，抽滤，定容，计算多酚得率，试验结果见图4。结果显示，微波时间100 s总酚得率最大。

图4 微波时间对总酚得率的影响

2.2 响应面法优化微波辅助提取山核桃外果皮总酚工艺

2.2.1 响应面分析因素的选取及分析方案

以单因素试验结果为基础，微波时间选定为100 s，对影响山核桃外果皮总酚提取率的主要因素(乙醇浓度、微波功率和液料比)进行中心组合试验(Box－Behnken)。试验因素和水平设计见表1，试验分析方案及结果见表2。

表1 Box－Behnken设计因素及水平表

表2 响应面分析方案与结果

2.2.2 总酚提取工艺的模型建立及其显著性检验

对表2中试验数据进行回归分析，得二次多元回归方程(模型)为:

对该模型进行方差分析，结果见表3，模型系数显著性检验见表4。

表3 回归模型方差分析

表4 回归系数显著性检验

由表3回归模型方差分析可知，F回归=56.51＞(F0.01(9，4)=14.66);P 值 ＜0.000 1，表明模型极显著。F失拟=5.17 ＜ (F0.05(9，3)=8.81，失拟项 P=0.073＞0.05，表明失拟不显著。该模型的相关系数R2=0.969，说明该二次模型能够拟合真实的试验结果，试验误差小［13］。由表4回归方程系数显著检验可知，乙醇浓度的一次项、二次项、料液比的一次项、微波功率的一次项和二次项均达到极显著水平(P＜0.01)，料液比和微波功率的交互项达到显著水平(P＜0.05)。

2.2.3 响应面分析与优化

乙醇浓度、料液比和微波功率交互作用对总酚得率的影响见图5～图7。由图5可知，料液比不变，随着乙醇浓度的增大，总酚得率呈先上升后下降的趋势;乙醇浓度恒定，增大料液比有利于提高总酚得率。由图6可知，微波功率不变，随着乙醇浓度的增大，总酚得率同样呈先上升后下降的趋势;乙醇浓度恒定，随着微波功率增大，总酚得率也呈先上升后下降的趋势。由图7可知，微波功率不变，总酚得率随着料液比的增大呈线性增加;料液比恒定，总酚得率随着微波功率增大而增加，但超过一定值后功率的增加对总酚得率有负面影响。

图5 乙醇浓度与料液比对总酚得率影响的响应面图

再对三维非线性回归模型(3)进行求一阶偏导，并令其为零，得出得率较高的条件:A=－0.20，B=1.0，C=0.14，转化为实际参数，即乙醇体积分数为56.0%，料液比为 1∶50，微波功率为 502.4 W，在此条件下总酚得率模型预测值为125.60 mg/g，验证值为123.41 mg/g，两者相对偏差为1.75% ＜5%。

2.3 山核桃外果皮提取物抗氧化特性

供给电子能力是酚类物质抗氧化重要作用之一，还原力体系的机理就是通过测定抗氧化剂提供电子的多少，来评价抗氧化活性的强弱［14］。由图8可知，提取物铁还原力随其浓度增加而上升，呈明显的量效关系。提取物还原力的IC50为0.431 mg/mL，而BHT的IC50则为0.140 mg/mL，说明提取物还原力相当于BHT的0.325倍。

DPPH已广泛用来评价各自植物和化合物的清除自由基的能力［15］。由图9可知，提取物的 DPPH清除能力随着浓度的增大呈上升趋势，当提取物浓度达到一定值后，清除能力变化变缓。通过对提取物浓度和DPPH清除率进行对数拟合，可得到提取物IC50(即清除率为50%时样品的浓度)为0.136 mg/mL，BHT 的 IC50为 0.122 mg/mL，说明提取物清除DPPH自由基的能力与BHT相当。β－胡萝卜素亚油酸体系的机理，就是通过抗氧化剂中和亚油酸自由基和体系中其他的自由基，抑制了其对不饱和β－胡萝卜素的攻击，从而减缓了β－胡萝卜素的褪色;抗氧化活性的强弱可以通过470 nm下吸光值的变化幅度来衡量［16］。由图10可知，提取物抗油脂氧化能力随着浓度的增大而增大。通过计算提取物的 IC50为 0.221 mg/g，BHT 的 IC50为 0.122 mg/g，说明提取物抗油脂氧化能力弱于BHT。

图10 提取物质量浓度与抗油脂氧化能力的关系

3 结论

山核桃外果皮总酚提取最佳工艺条件为:乙醇体积分数56.0%，料液比1∶50，微波功率502.4 W，微波时间100 s。在此条件下总酚得率模型预测值为125.60 mg/g，验证值为 123.41 mg/g，重复性试验结果较好，真空冷冻干燥后提取物总酚质量分数为17.45%。提取物还原力和抗油脂氧化能力弱于BHT，但对DPPH自由基的清除能力与BHT相当，因此山核桃外果皮提取物具有较强的抗氧化活性，是一种具有开发潜力的天然抗氧化剂。

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Study on Optimization of Microwave－Assisted Extraction of Total Phenol in Exocarp of Carya Cathayensis and its Antioxidant Activities

Wu Fenghua1，2Luo Zisheng1He Zhiping2Pang Linjiang2
(College of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University1，Hangzhou 310029)
(School of Agriculture and Food Science，Zhejiang A ＆ F University2，Lin'an 311300)

Based on the single － factor experiment，the method of response surface analysis with 3 factors including ethanol concentration，solvent－material ratio and microwave power on the yield of total phenol was adopted.The antioxidant of extract was studied in three different systems(reducing power，1，1 － diphenyl－ 2 － picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging activity and β －Carotene bleaching).The optimal conditions of microwave －assisted extraction were as follows:ethanol concentration 56.0%，solvent－material ratio 1∶50，microwave power 502.4 W and time 100 s;the actual value of total phenol was 123.41 mg/g，in close agreement with the value predicted by the mathematical model.The exocarp of Carya cathayensis extract obtained at the optimal conditions exhibited a strong scavenging DPPH ability comparable to BHT.

exocarp of Carya cathayensis，total phenol，extraction，response surface methodology，antioxidant

TQ432.2

A

1003－0174(2011)08－0109－06

浙江省自然科学基金 (Y3090428、Y3100422)，浙江林学院科研发展基金(2290000027)

2010－10－19

吴峰华，男，1979年出生，实验师，农产品贮藏与加工

罗自生，男，1972年出生，教授，农产品采后生物学