DA201－C大孔吸附树脂对腐乳多肽脱盐作用的研究

范 文 阮长青 王鹤霖

(黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319)

DA201－C大孔吸附树脂对腐乳多肽脱盐作用的研究

范 文 阮长青 王鹤霖

(黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319)

为去除腐乳中的盐分，利于其中活性肽的分离纯化，以腐乳多肽的回收率为指标，采用DA201－C大孔吸附树脂对超滤的水溶性低聚肽的脱盐工艺进行了研究。结果表明:DA201－C大孔吸附树脂对腐乳多肽较佳的脱盐工艺条件为上样浓度45 mg/mL、洗脱流速120 mL/h、解吸剂为70%乙醇。腐乳多肽经DA201－C大孔吸附树脂处理后脱盐率达到98.19%，肽回收率大于90%，抗氧化活性得到提高。利用DA201－C大孔吸附树脂是进行腐乳多肽脱盐处理的一种简便有效方法。

大孔吸附树脂 腐乳多肽 脱盐

腐乳是中国传统的大豆发酵制品，腐乳中的蛋白质主要以多肽的形式存在。与大豆蛋白相比，大豆多肽具有良好的物理性质和生理功能［1］。其中的低分子多肽已被逐步证明其在营养学方面优于蛋白质和游离的氨基酸。大豆多肽含有被激活的组氨酸、酪氨酸和其它活性物质，可改善人体消化、吸收功能，并能有效地捕捉人体内的自由基、甲氧基、氧化物等［2］，并能螯合重金属离子。倪莉等［3］采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)和高效液相色谱(HPLC)法对腐乳中的大豆蛋白酶解物进行分析，用改进的HPLC法对腐乳中多肽进行测定，结果显示腐乳中的含氮物质主要是分子质量小于10 000 u的肽和氨基酸。程丽娟等［4］研究发现腐乳中大豆蛋白经微生物作用后，中分子和低分子蛋白含量增多，这部分蛋白的分子质量一般较小，易于人体的吸收利用，也是生理活性最强的部分。目前，随着人们对大豆活性成分研究不断的深入，腐乳中的活性物质引起了人们的关注。

利用水法提取腐乳多肽时腐乳的盐类溶于提取物中，对腐乳多肽的纯度及活性产生影响，因此需要进行脱盐实验。目前生物活性物质的脱盐方法主要有透析、超滤和纳滤等，但是这些方法对小分子物质脱盐效果不佳或无法实现，尽管电渗析可以用于小分子物质的脱盐，但是回收率不高、能源消耗大［5］。大孔吸附树脂为非离子的高分子吸附剂，由苯乙烯、二乙烯苯、二甲丙烯酸酯等聚合而成网状孔穴结构，可根据分离物分子质量大小及极性不同进行分离，同时具有吸附、筛选的功能，其吸附特性与天然吸附剂特性相同。用于脱盐具有选择性好、吸附容量大、回收率高、再生处理方便、吸附迅速以及解吸容易、对原料生理生化性质影响小等特点［6－8］。宫霞［9］研究发现，DA201－C大孔吸附树脂对酪蛋白酶解液的脱盐效果最佳，陈季旺等［10］研究了利用DA201－C大孔吸附树脂对鱼降压肽的脱盐作用。

试验主要通过研究DA201－C大孔吸附树脂对腐乳多肽脱盐的效果影响，确定腐乳多肽的最佳脱盐工艺条件，为腐乳多肽的后续分离纯化、活性测定以及工业化生产较高高活性成分的腐乳提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

腐乳:黑龙江省克东腐乳有限公司;DA201－C大孔吸附树脂:江西市有机化工厂。

1.2 仪器

超滤膜包(10 000 u，3 000 u):德国Sartorius Stedim公司;BT600－2J蠕动泵:保定兰格恒流泵有限公司;11－2B型高速组织捣碎机:上海标本模型厂;JJ－1电动搅拌器:江苏金坛荣华仪器制造有限公司;SG3电导率仪:梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;玻璃层析柱(2.6 cm×30 cm)、HL－2D定时数显恒流泵、HD－9707电脑紫外检测仪器:上海精科实验有限公司;DBS－100电脑全自动部分收集器:上海沪西分析仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 腐乳多肽制备工艺

取体积较完整的腐乳，用水冲洗腐乳表面红曲，沥干、称重，利用组织捣碎机混匀，获得膏状样品。按1∶2.7比例加入蒸馏水，在40℃用电动搅拌器搅拌2.4 h，12 000 r/min离心，取上清液利用10 000 u超滤膜在40℃，压力0.2 MPa超滤1.5 h。将获得的超滤液再通过3 000 u超滤膜超滤，最终获得腐乳多肽超滤液［11］。

1.3.2 大孔树脂的预处理

将树脂用无水乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀，然后用无水乙醇洗至220 nm无吸收峰，再用去离子水洗净备用。然后用5%HCl溶液洗涤，再用去离子水洗至中性，最后用2%NaOH溶液洗涤，再用去离子水洗至中性备用［12］。

1.3.3 大孔树脂静态吸附能力的测定

在250 mL具塞锥形瓶中加入25 mL处理好的树脂，向其中加入浓度为45 mg/mL的腐乳粗肽溶液20 mL，用塞子塞好，将锥形瓶放入25℃恒温摇床中160 r/min振荡12 h，至吸附平衡，每隔0.5 h取样进行分析，测定溶液中多肽的浓度，并按下式计算吸附率和吸附量。

吸附量/mg/mL=(原液肽浓度－吸附后液体肽浓度)×溶液体积/湿树脂体积

1.3.4 大孔树脂对多肽的动态吸附及解吸

将DA201－C大孔吸附树脂装入2.6 cm×30 cm的层析柱，距柱口5 cm即可。在室温条件下一定浓度的粗肽溶液上柱，用紫外检测器检测流出液的A220nm。先用去离子水洗涤层析柱，每8 mL洗脱液收集一管，每管取1 mL稀释50倍，测定其电导率，当电导率的值保持不变时，换成70%浓度的乙醇进行洗脱，收集洗脱峰，冷冻干燥。

1.3.5 最佳样品浓度的确定

将腐乳粗肽溶液分别配置成 25、45、65、85 mg·mL－1上样，去离子水洗涤层析柱，当电导率值保持不变时，然后换成70%乙醇，固定流速为120 mL/h进行洗脱。以多肽的回收率确定最佳样品浓度。按下式计算多肽回收率。

1.3.6 最佳流速的确定

固定最佳腐乳多肽浓度进行上样，去离子水洗涤层析柱，当电导率值保持不变时，然后换成70%乙醇进行洗脱。分别将乙醇流速调成 60、90和120 mL/h洗脱大孔树脂柱，以多肽的回收率确定最佳流速。

1.3.7 原料成分与活性分析

1.3.7.1 抗氧化活性的测定

采用南京建成生物工程研究所的抗超氧阴离子自由基和羟自由基测试盒进行测定。

1.3.7.2 肽含量的测定

取2.5 mL样品溶液，加入2.5 mL 10%的三氟乙酸水溶液与之混合，静置10 min，在4 000 r/min下离心15 min然后用双缩脲法测定［13］。

1.3.7.3 灰分含量的测定

马弗炉灰化法(GB/T 5009.4—2003)［14］。

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂对腐乳多肽静态吸附能力

DA201－C大孔吸附树脂对腐乳多肽的静态吸附率和吸附量随时间变化曲线见图1。

图1 大孔树脂对腐乳多肽的吸附曲线

由图1可以看出，在静态吸附过程中，最初的3 h内吸附率迅速增加，而3 h后，吸附率增加缓慢。达到吸附平衡后，吸附率为95.10%，吸附量为7.61 mg/mL。说明DA201－C大孔吸附树脂对腐乳多肽吸附性能较好。DA201－C树脂是非极性树脂，是由偶极距很小的单体聚合制得，不带任何功能基，孔表的疏水性较强，可通过与多肽内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物。

2.2 大孔吸附树脂对腐乳多肽动态吸附和解吸能力

DA201－C大孔吸附树脂对腐乳多肽动态吸附的电导率和肽含量随洗脱体积的变化曲线见图2，动态解吸肽含量随洗脱体积的变化曲线见图3。

由图2可知，电导率在洗脱体积48 mL时达到最大值11.21 ms/cm，在洗脱体积达到400 mL时电导率趋于平稳，此时多肽溶液中的盐成分已几乎被洗脱出来。未被吸附的肽含量很少。然后用70%乙醇对腐乳多肽进行动态解吸。用乙醇对大孔吸附树脂进行洗脱实质上是一种由疏水性质决定的置换过程，乙醇能削弱蛋白质非极性侧链的排水倾向［15］，从而将疏水性肽从树脂上洗脱下来。由图3可知大部分多肽集中在50～160 mL洗脱体积处洗脱下来。

2.3 最佳样品浓度的确定

腐乳多肽进样量为40 mL，超滤液浓度为25、45、65、85 mg/mL，乙醇流速120 mL/h洗脱时，多肽回收率与样品浓度之间的关系见图4。

图4 样品浓度对腐乳多肽回收率的影响

结果显示，随着质量浓度的增加，多肽回收率逐渐变小，这是因为样品浓度小时，能与树脂充分接触，在疏水相互作用下，能有效被树脂吸附。与浓度大的样品相比，损失率较低，回收率较高。当样品质量浓度为25 mg/mL时，多肽回收率为95.28%，考虑到样品浓度与利用树脂吸附的因素，选择45 mg/mL为最佳质量浓度，多肽回收率为90.32%。

2.4 最佳流速的确定

腐乳多肽进样量为40 mL，超滤液浓度为45 mg/mL，乙醇流速分别为60、90和120 mL/h洗脱时，多肽回收率与洗脱剂流速之间的关系见图5。

图5 流速对腐乳多肽回收率的影响

结果显示，洗脱剂乙醇流速从60 mL/h增加到120 mL/h时，多肽回收率降低。流速主要影响溶质向树脂表面扩散，随着流速的增加，洗脱剂与树脂接触时间变短，多肽不能被完全置换下来。但是120 mL/h和60 mL/h相比，多肽回收率下降不明显，考虑到生产周期问题，最佳流速确定为120 mL/h。

2.5 脱盐效果分析

根据上述结果，确定腐乳多肽脱盐工艺的条件为多肽进样量40 mL、浓度为45 mg/mL，70%乙醇洗脱，流速为120 mL/h。在该工艺条件下对腐乳多肽进行脱盐，收集的洗脱液经真空浓缩和冷冻干燥，其活性分析见表1。

表1 脱盐前后腐乳多肽抗氧化活性比较

结果表明，脱盐后灰分含量明显降低，脱盐率达到98.19%，抑制羟自由基能力和抗超氧阴离子能力分别从 5.54 U/mgprot和 31.51 U/gprot提 高 到6.26 U/mgprot和 33.37 U/gprot。说明盐分对腐乳多肽的活性存在一定的影响，盐含量高，影响多肽的活性成分。脱盐后，腐乳多肽的抗氧化活性增强。

3 结论

DA201－C型大孔吸附树脂对腐乳多肽较佳脱盐工艺条件为上样浓度45 mg/mL、洗脱剂为70%乙醇，流速120 mL/h。腐乳多肽经DA201－C大孔吸附树脂处理后脱盐率达到 98.19%，回收率为90.32%，抗氧化活性得到提高，同时该过程还伴随着明显的纯化作用。因此DA201－C大孔吸附树脂综合性能较好，是进行腐乳多肽脱盐处理的一种简便有效方法，为腐乳多肽的进一步的分离纯化和活性研究奠定基础。

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Study on Desalination of DA201－C Macroporous Adsorption Resin on Fermented Bean Curd Polypeptide

Fan Wen Ruan Changqing Wang Helin
(College of food science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319)

In order to remove the salt of fermented bean curd，benefit the separation and purification of active peptide and realize the target of the recovery rate of fermented bean curd polypeptides，the desalting technology of fermented bean curd polypeptides which were water－soluble after ultrafiltration by DA201－C macroporous adsorption resin was investigated.The results indicated that the optimum condition for desalting was obtained as follows:loading sample concentration of 45 mg/mL，flow speed of 120 mL/h and 70%alcohol as eluent.Under these conditions，the ratio of fermented bean curd polypeptides desalination reached to 98.19%，and the recovery of peptides was more than 90%.Moreover，its antioxidant activity was enhanced.In conclusion，the desalination method by using DA201 －C macroporous adsorption resin applied to fermented bean curd polypeptides was a simple and available method.

macroporous adsorption resin，fermented bean curd polypeptides，desalting

TS214.2

A

1003－0174(2011)08－0105－04

2010－09－21

范文，女，1986年出生，硕士，食品营养与安全

阮长青，男，1968年出生，教授，硕士生导师，食品营养与安全