人核心蛋白聚糖基因靶向肺癌细胞特异性表达载体的构建及鉴定

吕俊锋 杜珍武 张玉成 张桂珍 (吉林大学中日联谊医院中心实验室,吉林 长春 30033)

肺癌的分子靶向药物治疗是近年新兴的一种治疗手段,具有高度选择性地杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅很少损伤正常细胞的特点,然而,恰恰由于靶向治疗是为攻击特异性靶分子而设计,所以须找到合适靶点才能发挥其疗效。研究发现核心蛋白聚糖 (decorin,DCN)在肿瘤细胞的生长转移过程中发挥重要作用,具有较好的抑制肿瘤细胞生长的作用〔1〕。因此,运用特定的基因表达调控元件,使 DCN基因特异地在肿瘤细胞中表达,从而提高DCN基因治疗安全性。人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂 (human secretory-leukop rotease inhibitor,hSLPI)是由呼吸道及生殖道黏膜上皮分泌的蛋白质,在非小细胞肺癌 (NSCLC)中高表达,hSLPI作为基因启动子具有相对更好的特异性,该基因启动子控制的特异表达及杀伤作用已在动物实验中得到证实〔2〕。本实验采用基因克隆技术从人外周血白细胞的基因组中钓取 SLPI启动子片段构建并鉴定 pcDNA3.1-hSLPI-decorin的真核表达体系,为进一步研究 decorin靶向基因治疗肺癌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌 A549细胞、质粒 pcDNA-decorin、细菌克隆宿主大肠杆菌 JM109和质粒 pcDNA3.1来自本实验室。各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶购于大连宝生物工程有限公司。质粒小提试剂盒、DNA marker购自天根生化科技有限公司。DNA凝胶回收试剂盒购自维特洁生化技术有限公司。抗人DCN单克隆抗体购于 R&D公司;Lipofectamine 2000购于 Invitrogen公司;G418购于宝泰克生物工程公司。

1.2 引物设计 根据 GenBank中 SLPI基因的 cDNA序列,上游 5′末端转录调控区的序列设计一对引物,上游引物:5′-TTCGACGCGTCTCACTGCAGCCTCAAAC-3′并在 5′端引入 MluⅠ酶切位点;下游引物:5′-TTCTAGCTAGCGGTGAAGGCAGGAGTGAC-3′并在 5′端引入 NheⅠ酶切位点。由上海生工公司合成。

1.3 SLPI基因启动子的克隆与鉴定 取新鲜的人外周血2 m l,按试剂盒说明提取细胞基因组 DNA,并以此为模板,应用TaqDNA聚合酶和上述引物进行 PCR扩增 SLPI基因启动子序列。PCR反应条件为:95℃预变性 5 m in,94℃变性1 min,58℃退火 45 s,72℃延伸 1 m in 40 s,共 35个循环,最后 72℃延伸10 m in。PCR产物通过 1%琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定。DNA凝胶回收试剂盒回收全部 PCR产物,得到的目的片段克隆到 pcDNA3.1载体中,并转化大肠杆菌 JM109,经蓝白筛选,随机挑取白色菌落,摇菌后提取质粒,以 MluⅠ和 NheⅠ双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,进行酶切鉴定,鉴定正确后得到 pcDNA3.1-SLPI菌株,再送交上海生工测序中心鉴定 。

1.4 双酶切 pcDNA3.1-decorin和 pcDNA3.1-hSLP I连接并转化 用 EcoR I、Xba I双酶切质粒 pcDNA3.1-decorin,凝胶回收DCN基因片段,通过 T4连接酶定向克隆入Mlu I和 Nhe I双酶切测序正确的载体 pcDNA3.1-hSLPI基因启动子 SLPI的下游,连接产物转化到已置备好的感受态 JM109菌中,并且涂布在含有氨卞青霉素的LB平板上,过夜后挑取单克隆菌,摇床过夜,质粒小提试剂盒提取重组质粒 pcDNA3.1-hSPL I-decorin。

1.5 质粒 pcDNA3.1-hSLPI-decorin的酶切鉴定 pcDNA3.1-hSPL I-decorin阳性重组克隆通过 Mlu I和 Nhe I、EcoR I和 Xba I酶切,酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳,进行初步鉴定。

图 1 SLPI启动子 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱

图 2 pcDNA3.1-SLPI酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图谱

2 结 果

2.1 SLPI基因启动子的克隆与鉴定

2.1.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 见图 1,在约 1 250 bp处获得 SLPI基因启动子单一目的条带。

2.1.2 酶切鉴定 pcDNA3.1-SLPI阳性重组克隆通过 Mlu I和 Nhe I双酶切,酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳,结果见图 2,在约 1 250 bp处切出目的片段。

2.1.3 序列测定 经酶切、PCR鉴定正确的质粒进行测序。将测序结果与 GenBank中的 SLPI基因上游 5′末端转录调控区序列比对,序列完全一致,测序结果为:

2.2 重组质粒 pcDNA3.1-hSLPI-deco rin的酶切鉴定 重组质粒 pcDNA3.1-hSLPI-decorin经MluⅠ和 NheⅠ、EcoR Ⅰ和 XbaⅠ酶切后 1%琼脂糖凝胶电泳,结果可见酶切下 1 000 bp的DCN基因片段及 1 250 bp处获得 SLPI基因启动子的条带,见图3。

图 3 pcDNA3.1-hSLPI-decorin酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图谱

3 讨 论

DCN是在细胞外基质中存在的小分子蛋白聚糖,1978年首次由美国国立卫生研究院骨科研究所的 Fisher教授分离、纯化。1986年 Krusius等〔4〕通过提取人胚胎成纤维细胞系IMR290RNA、构建 DNA文库,成功克隆 DCN基因并测序鉴定。研究发现,DCN在体外可抑制各种组织来源的肿瘤细胞增殖,尤其是 hNSCLC细胞,国外学者先给裸鼠接种 A431肺鳞状细胞癌细胞株,出现接种的瘤体后,多次瘤体内注射 DCN基因的腺病毒载体。结果移植瘤体生长减缓,瘤体与正常组织分界变清楚,并且在鳞状细胞癌的移植瘤体内出现了数个角化珠〔5〕。也就是 DCN基因在抑制肿瘤细胞生长的同时,还有促进细胞分化的作用。Araki等〔6〕进一步报道,巨细胞病毒介导的 DCN cDNA转染转移性乳腺癌细胞株MDA-MB-231,能表达 DCN,可以抑制肿瘤细胞的生长、运动和转移,骨转移下降了 90%,这些结果表明DCN对肿瘤转移有预防作用,并可能最终导致对转移性乳腺癌的更好的治疗。

文献〔4〕显示 SLPI基因在各种 NSCLC患者的癌组织中呈过量表达,在肝中表达极弱,相比于其他肺癌特异性启动子,SLP I基因启动子调控的肺癌组织类型更广。Maemondo等〔7〕应用该启动子调控肿瘤选择性完全复制型腺病毒治疗NSCLC取得较好的特异抗瘤效果,该研究为寻求针对肺癌的更有效的肿瘤基因治疗、最大限度地避免对正常组织的损伤打下基础。

为寻求针对肺癌的更有效的肿瘤基因治疗,最大限度地避免对正常组织的损伤,本研究选用 SLPI基因启动子作为NSCLC基因治疗的靶开关。通过 PCR方法从人外周血基因组中钓取 1.2 kb的 SLPI启动子,测序结果证实与 GenBank上 SLPI基因上游 5′末端转录调控区的序列完全一致。实验成功构建 SLP I启动子调控下的DCN报告基因表达载体,最终成功构建了真核表达载体 pcDNA3.1-hSLPI-decorin,这为进一步研究DCN靶向治疗肺癌作用及其抑癌机制奠定了基础。

1 Reed CC,Gauldie J,Iozzo RV.Supp ression of tumorigenicity by adenovirus-mediated gene transfer of decorin〔J〕.Oncogene,2002;21(23):3688-95.

2 Nukiwa T,Suzuki T,Fukuhara T,et a l.Secretory leukocyte pep tidase inhibitor and lung cancer〔J〕.Cancer Sci,2008;99(5):849-55.

3 Kr usius T,Ruoslahti E.Primary structure of an extracellular matrix p roteoglycan core p riein deduced from clone cDNA〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1986;83(20):7683-7.

4 Ameshima S,Ishizaki T,Demura Y,et a l.Increased secretory leukop rotease inhibitor in patientswith nons mall cell lung carcinoma〔J〕.Cancer,2000;89(7):1448.

5 Reed CC,Gauldie J,Iozzo RV.Supp ression of tumorigenicity by adenovirus mediated gene transfer of decorin〔J〕.Oncogene,2002;21(23):3688-95.

6 Araki K,Wakabayashi H,Shintani K,et a l.Decorin supp resses bone metastasis in a breast cancer cell line〔J〕.Oncology,2009;77(2):92-9.

7 Maemondo M,Saijo Y,Narumi K,et a l.Gene therapy with secretory leukop rotease inhibitor p romoter-controlled rep lication-competent adenovirus for non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer Res,2004;64(13):4611.