不同鼠龄小鼠脾细胞对过氧化氢诱导DNA损伤的修复能力

李国栋 阎雪冬 童坦君 张宗玉 (北京大学医学部北京大学衰老研究中心,北京 100191)

DNA损伤修复学说是对衰老分子机制科学阐释的众多学说之一,该学说认为,生物衰老时修复损伤 DNA的能力下降,致使基因组损伤不断积累,最终引起生物衰老。体内 (自由基)和体外 (紫外线、烷化剂等化学物质)多种理化因素均可以诱导细胞DNA的损伤,包括嘧啶二聚体形成、碱基损伤、单双链断裂和DNA交联等。细胞具有多种 DNA修复方式,比如直接修复、切除修复、错配修复和转录修复等。我中心在细胞 DNA损伤修复与细胞衰老方面进行了一系列的探索〔1～4〕。小鼠脾细胞对紫外线引起的DNA损伤的修复能力也随年龄增长明显下降〔2〕。甲基磺酸甲酯 (Methylmethanesulfonate,MMS)是一种烷化剂,可引起 DNA链断裂。衰老 2BS细胞对MMS诱导的 DNA损伤修复能力较年轻细胞明显下降〔3〕。为了进一步研究其他刺激因素与细胞衰老的关系,本文首次以 H2O2作为 DNA损伤诱导剂,观察了不同鼠龄的小鼠脾细胞对 H2O2刺激的敏感性以及DNA修复能力的差异。

1 材料与方法

1.1 实验材料 BALB/c纯种小鼠购自北京大学医学部实验动物中心,分青年鼠 (3～6月龄)及老年鼠 (28～32月龄)两个年龄组,每组 3只小鼠,雌雄随机。细胞培养基 RPM I 1640为G IBCO/BRL公司产品,胎牛血清为北京北郊农场血液制品所产品,刀豆蛋白 A(ConA)为美国 Sigma公司产品,3H-TdR购自中国原子能科学研究所,H2O2为北京化工厂产品,其余试剂均为进口分装或国产分析纯级。

1.2 脾细胞的制备 取小鼠脾脏,用 Hanks液洗 1次,然后换新的 Hanks液,在不锈钢纱网上磨碎,滤过的脾细胞1 000 r/min离心 5 m in,弃上清液,按每 108细胞加入 3 ml Tris氯化铵红细胞溶解缓冲液和 3 m l Hanks液,混合静置5～10 m in,于1 000 r/m in离心 5 min,弃上清液,细胞沉淀用 Hanks液洗两次后,重悬于含 10%胎牛血清的 RPM I-1640培养液,调整细胞浓度为 1×107细胞 /m l。加入 ConA至 3 mg/m l,37℃,5%CO2培养箱中继续培养。

1.3 S1核酸酶消化实验 用 200μmol/L H2O2处理脾细胞,冰浴 1 h,然后提取细胞基因组 DNA。取上述基因组 DNA 30μg,加入 S1核酸酶 10μg,再加入 10×S1核酸酶缓冲液150μl(0.28 mol/L NaCl,50 mmol/L NaAc,4.5 mmol/L ZnSO4,pH4.5),补水至总体积 1.5 m l。于 37℃保温1 h,冰浴骤冷后,加入 0.5 ml 2N的高氯酸 (PCA)终止反应,离心,收集上清液及沉淀。将沉淀的 DNA加入 0.5 m l 0.5 N的 PCA,在 90℃保温15 m in,水解沉淀的 DNA。分别测定 S1核酸酶消化的上清液及沉淀水解液的 DNA含量,计算 S1核酸酶对 DNA的消化率,消化率 %=上清液的 DNA含量 /(上清液的 DNA含量 +沉淀水解液的 DNA含量)×100。

1.4 非程序性DNA合成 将脾细胞用 RPM I1640稀释至 1×107细胞/m l,每个样品取 1 m l细胞悬液。向培养液中加入5 mmo l/L羟基脲 (Hydroxyurea,HU)以抑制 DNA半保留复制,37℃培养 1 h后,再加入 200μmol/L H2O2处理 1 h(对照组只用 HU处理,不加 H2O2)。离心收集沉淀的细胞,然后用 Hanks液洗两次,重新将细胞悬浮于含 5 mmol/L HU、2μCi/ml3H-TdR的培养液中,37℃继续培养不同的时间。将上述细胞收集到玻璃纤维膜上,分别以 10 m l磷酸盐缓冲液 (PBS),5 m三l氯乙酸 (TCA),5 ml无水乙醇洗膜,将膜 80℃干烤30 m in,放入8 m闪 l烁液中,以Beckman LS8000型液闪计数仪测定放射性计数率 (CPM)值。

1.5 统计学分析 采用 SPSS16.0统计软件进行处理,数据资料以表示,组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 单链DNA含量对比分析 S1核酸酶能够高度特异的水解单链DNA,故可用于单链DNA含量的测定。未经 H2O2处理时,老年鼠脾细胞单链 DNA的基础含量高于青年鼠 (P＜0.05),经 H2O2处理后,两组小鼠的单链 DNA含量与处理前相比均有明显提高 (P＜0.01)。提示无论老年鼠还是青年鼠的脾细胞 DNA均可被 H2O2氧化损伤,但最终的损伤程度两组之间没有明显差别。在小鼠脾细胞的 DNA损伤修复实验中,细胞经 H2O2处理后,更换正常培养液并于 37℃继续培养 6 h,以使DNA进行修复。修复结果表明,老年鼠和青年鼠的单链 DNA含量均明显下降,但青年鼠的下降比例 (13.4%)显著大于老年鼠 (6.8%)(P＜0.05),小鼠脾细胞对单链 DNA损伤的修复能力随年龄的增加而明显下降。见表 1。

表 1 不同鼠龄小鼠脾细胞DNA修复前后的单链DNA含量

表 1 不同鼠龄小鼠脾细胞DNA修复前后的单链DNA含量

与青年鼠比较:1)P＜0.05,与未处理组比较:2)P＜0.01

青年鼠 6.6±2.1 31.9±4.82) 18.5±2.8老年鼠 12.7±3.11) 40.1±6.02) 33.3±4.51)

2.2 切除修复能力对比分析 与细胞 DNA复制不同,细胞损伤时修复性的 DNA合成主要存在于其他细胞周期,称为非程序性 DNA合成 (Unscheduled DNA Synthesis,UDS),因此 UDS水平的高低常用于指示细胞对DNA损伤的切除修复能力。青年鼠在 H2O2刺激大约 12 h后3H-TdR掺入值 (CPM)达到高峰,尽管老年鼠此时也基本达到最大值,但其测量值的绝对水平大约只有青年鼠的 1/3(P＜0.01)。H2O2刺激导致脾细胞DNA损伤后,老年鼠DNA切除修复的启动速度和修复程度均远远低于青年鼠。见表 2。

表 2 不同鼠龄小鼠脾细胞经 H2 O2处理后的切除修复能力

表 2 不同鼠龄小鼠脾细胞经 H2 O2处理后的切除修复能力

与青年鼠比较:1)P＜0.01

组别 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h青年鼠 43±12 174±21 207±25 360±40 348±38老年鼠 40±19 81±221) 91±141) 130±201) 139±231)

3 讨 论

H2O2可由内源性代谢产生,在 Fe2+的参与下通过 Fenton反应转化为氧化活性更强的羟基自由基,后者攻击 DNA双链结构,可使 DNA的单链和双链断裂,是加速细胞衰老进程的重要因素之一。既往研究显示,H2O2可诱导人二倍体成纤维细胞(2BS细胞)的不可逆性早衰并伴随 DNA修复能力的明显下降〔4〕。本实验首次研究了不同鼠龄小鼠脾细胞对 H2O2的敏感性并对比分析了它们的 DNA损伤修复能力。结果表明,老年鼠和青年鼠对 H2O2的刺激表现出了相似的敏感性,但 DNA的修复合成能力差异很大。

DNA损伤修复是个很复杂的过程,首先是共济失调-毛细血管扩张突变基因 (AT M)、p53等蛋白分子对损伤部位的识别与信号传递,通过诱发蛋白激酶瀑布效应引起细胞周期阻滞并最终启动 DNA修复〔5〕。DNA修复包括直接修复、切除修复、错配修复、重组修复等多种机制。H2O2导致的 DNA损伤以单链断裂更为常见,出现频率大约为双链断裂的 2 000倍。DNA单链断裂的主要修复途径是依赖 DNA连接酶的重接修复,是DNA直接修复的一种。单链特异性的 S1核酸酶消化实验显示,H2O2刺激可以明显增加不同年龄小鼠脾细胞的单链 DNA的含量,但是老年鼠对DNA单链断裂的修复能力低于青年鼠。切除修复是一种多组分、多步骤的修复途径,普遍存在于各种生物细胞中,是真核细胞最主要的 DNA修复机制。切除修复包括碱基切除修复 (Base excision repair,BER)和核苷酸切除修复 (Nucleotide excision repair,NER)两种,可以修复包括嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂、DNA交联等多种损伤。非程序性DNA合成 (UDS)是一种检测切除修复的经典方法,本试验的结果显示,老年鼠脾细胞在 H2O2刺激后,不仅单链断裂的直接修复能力比青年鼠显著下降,而且 DNA的切除修复能力也明显降低。综上,H2O2能够诱导小鼠脾细胞的 DNA损伤,老年小鼠对该损伤的修复能力明显低于青年鼠,从而为 DNA损伤积累参与衰老过程的科学论断提供了新的实验依据。

1 Tian F,Tong TJ,Zhang ZY,et a l.Age-dependent down-Regulation ofmitochondrial 8-oxoguanine DNA glycosylase in SAM-P/8 mouse brain and its effect on brain〔J〕.Rejuvenation Res,2009;12(3):209-15.

2 闫雪冬,张宗玉,童坦君 .老年小鼠脾细胞DNA修复能力的变化及gadd45和 gadd153基因的可诱导性改变〔J〕.北京医科大学学报,1999;31(4):289-92.

3 段建明,张宗玉,童坦君 .人衰老二倍体成纤维细胞对烷化剂损伤的应答〔J〕.中华老年医学杂志,2003;22(5):288-91.

4 Duan J,Duan J,Zhang ZY,et a l.Irreversible cellular senescence induced by p rolonged exposure to H2O2involves DNA-damage-and-repair genes and telomere shortening〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2005;37(7):1407-20.

5 于廷曦,朱应葆,童坦君 .DNA损伤与细胞周期调控〔J〕.生物化学与生物物理进展,1999;26(4):350.

〔2010-05-10收稿 2010-07-16修回〕