4种真菌制备海藻曲及其产香特征的初步研究

刘 烨，吴 舟，王国良，李共国

（1.上海海洋大学食品学院，上海201300；2.浙江万里学院宁波市农产品加工技术重点实验室，浙江宁波315100）

4种真菌制备海藻曲及其产香特征的初步研究

刘 烨1，吴 舟2，王国良2，李共国2

（1.上海海洋大学食品学院，上海201300；2.浙江万里学院宁波市农产品加工技术重点实验室，浙江宁波315100）

以曲中蛋白酶和糖化酶活力为主要指标，研究了4种真菌单独制备海藻曲及其产香特征。结果表明：米曲霉在麸皮制曲中的繁殖能力最强，黑曲霉与鲁氏毛霉次之，鲁氏酵母生长速度最慢。以黑曲霉为菌种，物料比为海带∶大豆∶面粉=6∶3∶1制备的海带曲中蛋白酶活力高达4.15g氨基态氮/100g（干基），糖化酶活力为948.8U/g。应用GC-MS方法测得黑曲霉海带曲发酵3d和8d时的风味物质六大类共31种物质，其中构成良好风味的主要成分为丁酸丁酯、正丁醇、丁酸和乙酸乙酯，它们的总相对含量分别为89.66%（3d）和83.06%（8d）。

海藻，单菌种，制曲，风味

海藻所含的微量元素和各种维生素量远超过陆地植物［1］，因此，近年来海藻广泛应用于功能性食品、特效食品添加剂及保健品领域，而将微生物发酵用于海藻的加工研究却鲜有报道。由于有些真菌可产蛋白酶、淀粉酶和糖化酶等多种酶，利用它们的协同作用发酵，得到的产品具有营养丰富、易于消化吸收等优点［2］。如果这些微生物用于海藻酱发酵，可以很好地覆盖海藻腥味，提高其使用价值和经济效益。因此，本文将米曲霉、黑曲酶、鲁氏毛霉和鲁氏酵母分别接种到添加了不同辅料的海藻中，以探索最优的发酵菌种和添加辅料，并用GC-MS方法测定分析酱醅的风味物质，为海藻酱的加工开发提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

干制海带、紫菜、面粉、大豆、蚕豆 均为市售；米曲霉 GW3042、黑曲霉 As 3.1860、鲁氏毛霉 As 3.3447、鲁氏酵母As 2.180 购自广州市微生物研究所；甲醛、无水乙醇、碘化钾、无水乙酸钠、硫代硫酸钠、氢氧化钠、可溶性淀粉、碘、酚酞、麝香草酚蓝均为分析纯。

HR73P型水分测定仪，电子天平，高速万能粉碎机，鼓风干燥箱，灭菌锅，生物显微镜，智能生化培养箱，恒温水浴锅，气相色谱-质谱联用仪。

1.2 实验方法

1.2.1 海藻酱加工流程

表1 不同种曲的生长状况比较

表2 添加不同辅料后海带和紫菜曲种的孢子量（109个/g）

表3 海带（紫菜）曲中蛋白酶和糖化酶活力、曲水分及其香味特征

1.2.2 不同种曲的生长比较 麸皮与水混合后制成半固体培养基放入灭菌锅内［3］，0.1MPa灭菌30min，取出后趁热摇散锥形瓶中的麸皮块，分别接入各种含菌蒸馏水10mL（含孢子量108个/mL）。在30℃下培养，当菌丝蔓延将麸皮连成饼状时，即行扣瓶（将瓶轻轻放倒，使麸皮饼脱离瓶底）［4］，3d后测定孢子量。测定方法为称取培养成的各种曲1g，溶于20mL蒸馏水中（含2‰吐温），在显微镜下进行计数，并对它们的生长情况进行感官描述。

1.2.3 制曲 海藻、豆和面粉按上述工艺流程杀菌冷却后混合，接入5%的种曲，发酵3d后制成成曲。

1.2.4 海藻曲中添加不同辅料实验 在海带和紫菜中分别添加一定比例的面粉、蚕豆+面粉和大豆+面粉。添加比例分别为海带（紫菜）∶面粉=9∶1；海带（紫菜）∶蚕豆∶面粉=6∶3∶1；海带（紫菜）∶大豆∶面粉= 6∶3∶1，以此来比较各种曲的生长情况。

1.2.5 海藻曲指标测定 海藻曲中蛋白酶和糖化酶活力测定分别采用SB/T 10317-1999（甲醛法）和GB 8276-87法，曲水分测定用HR73P型水分测定仪。

1.2.6 风味特征分析 用顶空气相色谱-质谱联用法测定样品的风味物质；通过GC-MS分析测出总离子流图，分析样品中主要的风味物质成分及其相对含量［5］。色谱条件：HP-INNOWAX柱（30m× 250μmi.d×0.25μm，df）；进样口温度，250℃；程序升温，50℃（2min）→240℃（15min）；氦气流速为1mL/min。质谱条件：EI源电子能量70eV，电子倍增器电压1650eV；质量扫描范围为30～550AMU，离子源温度230℃，四极杆温度130℃。

2 结果与讨论

2.1 不同种曲的生长状况

米曲霉在麸皮中的繁殖能力最强，黑曲霉与鲁氏毛霉次之，鲁氏酵母生长速度最慢。鲁氏酵母孢子量比前3种菌种少4～5个数量级（见表1）。

2.2 添加不同辅料后海藻曲的发酵特征

在海带和紫菜中添加一定比例的大豆或者蚕豆时，除鲁氏酵母曲种的孢子量明显较低以外，其余各曲种的生长状态较好；在不同辅料配比中，仅添加面粉的曲种其孢子量明显下降，黑曲在海带中添加大豆明显比添加蚕豆好，米曲则刚好相反（表2）。

2.3 海藻曲的蛋白酶和糖化酶活力及产香特征

4种真菌分别对添加辅料的海带和紫菜进行单菌种制曲，各海藻曲的蛋白酶和糖化酶活力及产香特征见表3。曲中的蛋白酶活力，除黑曲霉制成的海带曲和米曲霉制成的紫菜曲以添加大豆为最高，分别达4.15、2.98g氨基态氮/100g（干基）外，其余各藻曲均以添加蚕豆为最高；曲中的糖化酶活力，除鲁氏毛霉制成的紫菜曲以添加大豆为最高外，其余各藻曲也均以添加蚕豆为最高，其中尤以黑曲霉制成的海带曲糖化酶活力为最高，达2308.0U/g；不添加蚕豆或大豆时，曲中的水分较高；曲中的香味以接种黑曲霉和鲁氏毛霉曲种为较好，接种鲁氏酵母曲种产生了微臭气味，可能与鲁氏酵母生长速度慢，孢子量少，易被细菌污染有关。

表4 样品发酵3d和8d风味成分种类与其相对含量变化

制曲的目的是使真菌分泌大量的蛋白酶、糖化酶和脂肪酶等酶类，以备后期发酵所用，其中尤以蛋白酶为最重要，直接影响原料的蛋白利用率和最终产品的风味［6］。可见，用黑曲霉制备的海带曲具有最高的蛋白酶活力和较高的糖化酶活力，香味也较好，其最好的添加辅料是大豆和面粉。

2.4 产香特征分析

由2.3实验结果，取黑曲霉在海带+大豆+面粉的混合料中发酵制得的曲为样品。用GC-MS方法分别测得酱醅发酵时间为3d和8d时挥发性物质总离子流色谱图，通过谱图检索并结合有关文献，鉴定出31种物质，分别为醇（2种）、醛酮（4种）、酸（3种）、烃（4种）、酯（14种）和杂环化合物（4种）六大类。10种成分在两次测定时同时检出，11种成分为发酵3d特有，10种成分为发酵8d特有。风味物质的主要成分与其相对含量变化见表4。

正丁醇、丁酸丁酯、丙酮、丁酸、乙酸丁酯等为3d和8d两次测量都存在的主要成分，这些成分总和分别超过96.55%和88.59%；酯类和醇类可以产生使人愉快的气味，酸类可以缓和咸味，使口感柔和［7］。正丁醇的相对含量随着发酵时间的推延下降明显，可能是由于醇类可与多种酸作用生成酯类，这也说明了随着发酵时间的延长，酯类物质含量有所增加的原因。杨海帆等证明野西瓜果实正丁醇提取物有抗肿瘤作用［8］，丁酸丁酯具有苹果、香蕉、菠萝等果香香味，主要用于配制果实香精，是我国GB 2760-86规定允许使用的食用香精［9］，而影响风味形成的主要物质可能是丙酮，其对海藻酱风味的影响还有待进一步的研究。

3 结论

3.1 4种真菌种中，以米曲霉在麸皮中的繁殖能力最强，黑曲霉与毛霉次之，酵母生长速度最慢，使酵母种曲中的孢子量仅为2.1×106个/g，导致其在制曲过程中被细菌污染，产生臭味。

3.2 用黑曲霉制备种曲，添加大豆+面粉辅料制成的海带曲，其蛋白酶活力最高，达4.15g氨基态氮/ 100g（干基），糖化酶活力为948.8U/g，是海带加工海藻酱较好的菌种。

3.3 应用GC-MS方法鉴定出醇、醛酮、酸、烃、酯、杂环化合物六大类，31种物质。在发酵3d和8d两次测定中，风味物质成分及其相对含量变化较大，但相对含量较高的主要风味物质正丁醇、丁酸丁酯、丁酸和乙酸乙酯等较稳定，相对含量的变化主要表现为醇类物质转变为酯类物质。

［1］SEIBIN A，TERUKO A.Vegetable from the sea［M］.Tokyo：Japan publication，1983：33-51.

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［3］乐超银，邵伟，梁维勇，等.米曲霉发酵大豆多肽工艺条件研究［J］.中国酿造，2007（6）：25-28.

［4］毛青钟，鲁瑞刚，陈宝良，等.米曲霉菌制备生麦曲的方法［J］.江苏食品与发酵，2006（3）：37-38.

［5］姚伟琴，李锋格，尚德军，等.自动顶空气相色谱法测定番茄酱中乙烯利的残留量［J］.中国卫生检验杂志，2008（8）：1537-1538.

［6］刘颖，王佳瑞，刘婧美，等.米曲霉菌制备高蛋白酶活力酱曲工艺探讨［J］.现代食品技术，2009，25（9）：1049-1051.

［7］张艳芳，陶文忻.两种发酵酱油风味物质的分析研究［J］.精细化工，2008，25（5）：486-490.

［8］杨海帆，于蕾，庞琳琳，等.野西瓜正丁醇提取物的化学成分与抗肿瘤作用［J］.哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2009，25（3）：264-267.

［9］杨水金，罗义.稀土改性的固体超强酸S/TiO2-La2O3催化合成丁酸丁酯［J］.食品工业科技，2005，26（6）：156-158.

Prelimiary study on fermentation and flavour specificity of producing seaweed leaven using four fungi

LIU Ye1，WU Zhou2，WANG Guo-liang2，LI Gong-guo2
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201300，China；2.Key Lab of Agricultural Processing Technology of Ningbo，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

The fermentation and flavour specificity of producing seaweed leaven using four fungi were studied by following parameters：proteinase and glucoamylase activity.Results showed that Aspergillus oryzae（GW3042）grew up the fastest in all of the four fungi，Aspergillus nige（rAs 3.1860）and Mucor rouxi（iAs 3.3447）took the second place，developed much faster than that of Saccharomyces roux（iiAs 2.180）in preparing bran mother culture.Kelp leaven，which produced with Aspergillus niger，materal proportion of kelp∶soybean∶flour=6∶3∶1，was of high proteinase activity for 4.15g AAN/100g（dry substrate），948.8U/g of glucoamylase activity.According to GC-MS analysis，a total of 31 species volatiles were indentified in the leaven which were fermented after 3d and 8d，among these the main flavour substances were butyl butyrate，n-butanol，butyric acid and ethyl acetate，their total relative content were 89.66%and 83.06%，respectively.

seaweed；single fungus；producing leaven；flavour

TS254.1

A

1002-0306（2011）02-0139-04

2009-10-23

刘烨（1985-），女，硕士在读，研究方向：水产品加工。