反相高效液相色谱法测定食品中的多种黄色工业染料

杨 琳，陈青俊，丁献荣，汪庆旗，徐双阳

（浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州310009）

反相高效液相色谱法测定食品中的多种黄色工业染料

杨 琳，陈青俊，丁献荣，汪庆旗，徐双阳

（浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州310009）

食品中的非食用色素工业染料经无水乙醇超声振荡数次提取，于45℃真空浓缩，高速离心，采用HPLC系统用20mmol/L醋酸铵溶液和甲醇梯度洗脱，在二极管阵列检测器430nm和480nm下检测，用外标法峰面积定量。结果显示：五种工业染料在0～20.0μg/mL浓度范围内的峰面积与浓度的线性关系良好；加标回收率为90.9%～98.9%。该方法简便易行，准确可靠。

碱性橙嫩黄O，碱性橙2，碱性橙21，碱性橙22，酸性间胺黄，高效液相色谱，二极管阵列检测器

近年来，随着我国经济的飞速发展，食品安全问题越来越受到人们的重视，但是却有一些不法商贩为了一己私利，为了增加食品的色泽光亮，以次充好，在鲜海鱼、豆制品、腐竹等食品中使用黄色的工业染料，这类工业染料大都属于偶氮类染料，主要用于纺织品、皮革制品及木制品的染色，已经被认定是一种可以使人致癌的物质，不得用于与人体长期直接接触的纺织和服装产品中，根据《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准》及《中华人民共和国食品卫生法》的相关规定，为禁止用作食品添加剂的化学制品。目前工业染料的品种繁多，就需要建立一个快速准确测定食品中多种工业染料的方法。本方法针对市场上曾经出现过的五种常用的黄色工业染料：碱性嫩黄O，碱性橙2，碱性橙21，碱性橙22，酸性间胺黄，从研究工业染料的提取、富集等前处理条件，运用高效液相色谱分离，利用DAD二极管阵列检测器进行检测，建立了一套适合实验室快速准确测定食品中多种黄色工业染料的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇 色谱纯；标准品碱性橙嫩黄O、碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、酸性间胺黄 含量≥99%，sigma；标准储备液 分别准确称取0.1000g五种工业染料标准物质，用50%甲醇水溶解并定容到100mL，配成浓度为1.00mg/mL的储备液；测定前将储备液稀释50倍到20μg/mL，此为标准工作液；醋酸铵，无水乙醇。

高效液相色谱仪 125双溶剂泵，168二极管阵列检测器，508自动进样器，32Karat数据工作站；超声波振荡器，高速离心机（16000r/min），旋转蒸发仪。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 称取20g左右（准确至0.01g）均质样品，置于150mL烧杯中，加入2g无水硫酸钠搅拌均匀，加入30mL无水乙醇超声提取15min，将提取液用滤液过滤到圆底烧瓶里，再加入30mL无水乙醇，重复上述操作三次，合并提取液，于45℃真空浓缩至近干，氮气吹干后用流动相洗脱并定容至5mL容量瓶中，样液用高速离心机12000r/min离心10min，取上清液待测。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent C18柱（4.6× 150mm，5μm）；流动相：0.02mol/L醋酸铵缓冲液和甲醇按以下梯度洗脱：0～8min，甲醇 11%～65%；8～14min，甲醇65%～73%；16～18min，甲醇73%～100%；20～24min，甲醇100%～11%；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：430nm（碱性橙嫩黄O、碱性橙2、酸性间胺黄），480nm（碱性橙21、碱性橙22）。

1.2.3 吸收波长的选择 分别取适量的标样用50%的甲醇水溶液溶解，配制成浓度为10μg/mL的溶液，采用二极管阵列检测器在190～600nm范围内进行在线光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 吸收波长的选择

各标准品的二极管阵列检测器190～600nm范围内的光谱扫描图如图1～图5所示。由图可知，碱性橙2的λmax=439nm（图1），碱性橙嫩黄O的λmax= 430nm（图2），酸性间胺黄的λmax=430nm（图3），碱性橙21的λmax=485nm（图4），碱性橙22的λmax= 485nm（图5）。为了可以同时测定多种黄色工业染料，达到最佳的灵敏度，本实验综合考虑选择波长430nm和480nm为检测波长。

图1 碱性橙2的光谱扫描图

图2 碱性橙嫩黄O的光谱扫描图

图3 酸性间胺黄的光谱扫描图

2.2 标样图谱

在1.2.2色谱条件下，标样图谱见图6和图7。按照色谱峰的保留时间定性，外标法峰面积定量。

2.3 样品预处理条件的选择

2.3.1 提取时间的选择 为研究提取时间对样品中工业染料测定值的影响，分别考察了10、15、20min的提取率。实验结果表明，随着提取时间的增加，样品中工业染料的测定值有所升高，但提取时间为15min和20min重复提取三次，测定值几乎无差别，因此选择提取时间为15min。

2.3.2 浓缩方式的选择 为了提高方法的检出限，样品要经过浓缩，采取了水浴蒸干和低温真空浓缩两种方法，实验结果见表1。

图4 碱性橙21的光谱扫描图

图5 碱性橙22的光谱扫描图

图6 扫描范围168～430nm

图7 扫描范围168～480nm

表1 不同浓缩方式回收率结果（%，n=3）

实验发现，碱性橙2和碱性橙嫩黄O受温度的影响很大，当采用水浴蒸干时，过高的温度使碱性橙2和碱性橙嫩黄O回收率很低；碱性橙2和碱性橙嫩黄O在50℃以上容易分解，低温真空浓缩可以得到比较高的回收率，但是过低的温度需要花费很长的时间，浓缩的效果也欠佳，本实验采用了45℃真空浓缩，可以达到比较满意的效果。

表2 回归方程、检出限及回收率结果

2.4 线性关系、检测限、精密度和回收率

五种工业染料的定量标准曲线、检测限、精密度和回收率见表2。

2.5 干扰性实验

在本研究方法的色谱条件下，食品中常见的添加剂苯甲酸、山梨酸、糖精钠、咖啡因在430、480nm几乎无吸收，不会干扰碱性橙的测定；食品中常见的食用色素柠檬黄、日落黄的保留时间分别为4.2、7.3min（色谱图见图8），均不干扰碱性橙嫩黄O、碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22，酸性间胺黄的测定。

3 结论

称取20g左右的样品，经无水乙醇超声振荡数次提取，于45℃真空浓缩，高速离心，上清液进HPLC以20mmol/L醋酸铵溶液和甲醇梯度洗脱，在二极管阵列检测器430nm和480nm下检测，用外标法峰面积定量。五种工业橙染料在0～20.0μg/mL浓度范围内的峰面积与浓度的线性关系良好；方法的最低检测限碱性橙嫩黄 O为 0.1μg/mL，碱性橙 2为 0.1μg/mL，碱性橙 21为 0.1μg/mL，碱性橙 22为0.1μg/mL，酸性间胺黄为 0.1μg/mL（以进样浓度计）；方法的回收率为90.9%～98.9%。总之，本方法用于食品多种工业染料的测定，具有准确、快速、简便等优点。

图8 8种混合标准溶液色谱图（Det 168～430nm）

［1］铁晓威，黄百芬，任一平.RP-HPLC法测定染色黄鱼中碱性橙含量［J］.中国卫生检验杂志，2004，14（1）：59-60.

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RP-HPLC determination of five kinds of yellow industrial dyes in foods

YANG Lin，CHEN Qing-jun，DING Xian-rong，WANG Qing-qi，XU Shuang-yang
（Zhejiang Gongzheng Testing Center Inc.，Hangzhou 310009，China）

A method for determination of inedible industrial colorants in foods by high performance liquid chromatography（HPLC）was established.Samples were extracted by anhydrous alcohol using ultrasonic.The extraction was concentrated in vacuum and 45℃，then analyzed by HPLC with 20mmol/L ammonium acetate and methanol，detection wavelength were 430nm and 480nm.The results showed thatindustrial dyes in the concentration of 0～20.0μg/mL had good linearity with peak area.The recovery rate with standard addition was 90.9%～98.0%.The method was simple，feasible and accurate.

auramine O；chrysoidine G；astrazon Orange G；astrazon Orange R；metanil yellow；HPLC；DAD

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0350-03

2010-02-01

杨琳（1979-），女，在读硕士，工程师，研究方向：食品中微量元素测定和高效液相色谱的分析。