响应面法对乳清中乳糖酶解工艺条件的研究

项丽丽，季妮娜，粘靖祺，霍贵成

（乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）

响应面法对乳清中乳糖酶解工艺条件的研究

项丽丽，季妮娜，粘靖祺，霍贵成*

（乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）

对乳清中的乳糖在β-半乳糖苷酶催化下的水解作用进行了研究，利用响应面方法系统地考察了不同的工艺参数（酶添加量、pH和温度）对乳糖水解度的影响。通过响应面模型确定了酶水解乳清中乳糖的最优条件，即乳糖酶添加量1.03g/kg乳清、pH6.73、水解温度为37.26℃，在此条件下水解3h，乳糖水解度为66.02%。

乳清，乳糖水解，β-半乳糖苷酶，响应面法

乳清是干酪制作时产生的副产物，过去通常被当作废物处理掉，但由于其乳糖含量较高，极易腐败，大量消耗水中的溶解氧，从而造成了很严重的环境污染问题。另外，乳清还是优质蛋白质和多种维生素及矿物质的良好来源。近年来，世界各国的学者们都在努力寻找恰当的途径来将乳清更好地开发利用到食品中［1］。β-半乳糖苷酶是嗜热乳酸菌产生的一种胞内酶，它可以将牛乳或乳清中的乳糖水解成两部分：半乳糖和葡萄糖，由于水解后的混合糖浆要比乳糖本身甜［2］，而且更容易被人消化吸收［3］，解除乳糖不耐症人群的困扰。因此，用β-半乳糖苷酶水解乳糖后的乳清可以直接发酵成乳清饮料或应用在糖果、糕点等食品加工中。本实验旨在采用响应面方法，通过Design-Expert 6.0软件分析数据，得到回归方程，最终确定β-半乳糖苷酶水解乳清中乳糖的最佳工艺参数，为今后生产和研究低乳糖乳清饮料和其他产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

脱盐乳清粉D90 法国爱慕公司，乳糖84%、水分2%、蛋白质12.2%、脂肪1%、灰分0.7%；β-半乳糖苷酶 哈尔滨美华生物技术股份有限公司；盐酸、氢氧化钠 均为分析纯。

葡萄糖测定试剂盒 上海荣盛生物技术有限公司；DELTA320精密pH计、PL2002分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；摇床振荡培养箱 上海智成分析仪器有限公司；UV2401PC紫外可见光分光光度计 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳糖酶水解工艺流程 乳清粉→复原（10%）→用2mol/L NaOH或1mol/L HCl调整pH→杀菌→冷却降温→加入乳糖酶→放入摇床中保温水解3h→加热灭酶→冷却降温→测水解率

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 杀菌条件 复原后的乳清采用巴氏杀菌，水浴65℃，30min后冷水冷却至40℃左右。

1.2.2.2 添加乳糖酶 在无菌条件下将称量好的乳糖酶添加到乳清中，然后立即放入摇床中振荡水解。

1.2.2.3 摇床振荡条件 使用前先升温至所需温度，调整摇床转速200r/min。

1.2.2.4 灭酶 水解完毕后，将水解液立即放入水浴锅中95℃，5min使酶失活。

表1 中心组合旋转设计因素水平编码表

1.2.3 响应面方法分析 采用Design-Expert软件进行响应面分析并作图，选择pH（x1），酶添加量（x2）和水解温度（x3）三个因素，软件根据中心组合旋转设计（CCRD）［4］对各因素进行优化，每个因素包含五个水平，编码为-α、-1、0、+1、+α，α=2因素个数/4=23/4= 1.682，0水平表示实验所选择的中心点，-1和+1表示上水平和下水平，中心点选择依据为乳糖酶使用说明书及前期所做的摸索性实验，所有实验组合均做3次重复，并以乳糖水解度（DH，%）的平均值作为响应值。响应面方法分析数据的方式可以通过下面的二次方程来解释：

其中，y是响应变量（乳糖水解率DH%），β0是设计的中心点所对应的响应值，βi、βii和βij分别是线性、二次项和交叉相乘或交互回归项的系数，xi、xj是独立变量的编码（x1：pH，x2：酶添加量，x3：水解温度）［5］。利用F-检验对实验得到的回归系数进行显著性检验。具体的实验编码表见表1，实验设计方案及结果见表2。

表2 响应面实验设计方案及结果

1.2.4 乳糖含量的测定 采用直接滴定法（GBT5009.7-2003）测定乳清粉中的乳糖含量。

1.2.5 乳糖水解率的测定 采用酶催化法［6］。

2 结果与讨论

2.1 响应面模型的建立与检验

采用Design-Expert软件，以表1的因素水平制备23组乳糖水解液，其中，中心点处重复9次，分别测定其水解度，实施方案及结果见表2。对所得到的响应面模型进行方差分析（ANOVA），结果如表3所示。

表3 响应面回归模型的方差分析

可知，在5%显著水平上，除交互项pH与酶添加量外，所有因素及其交互项对乳清中乳糖水解度均有显著作用（P＜0.05），而模型失拟项为不显著（P＞0.05），这更说明此模型适合乳糖水解度的分析。模型的拟合度R2为0.9793（R2＞0.75表明模型具有实用性），说明预测值与实测值之间具有高度的相关性；校正决定系数为0.9650，说明该模型能解释96.50%的响应值的变化，仅有3.5%不能用此模型来解释。通过比较F值大小，我们可以分析各个因素对水解度影响的重要程度。从表3可知，3个一次项的F值大小依次为x3＞x2＞x1，且各项的F值检验均达到了极显著的水平（P＜0.01），说明3个因子对乳糖水解度均存在极显著的影响。从交互项的回归系数可知，只有x1和x2之间的交互作用不显著，而其他因子之间的交互作用均显著。

根据各项的回归系数，得到三因素对乳清中乳糖水解度影响的回归方程：

将实际值替换编码值，并去掉作用不显著项，可得到实际回归方程：

其中，y为乳糖水解度（%）。

2.2 pH、酶添加量及水解温度对响应值的影响

为得到乳糖水解度最大值时各因素的最佳条件，分别将各因素固定在中心点，利用Design-Expert软件作出其他两个因素对响应值作用的响应面图，如图1～图3所示。

图1 pH和水解温度对水解度的影响

图2 水解温度和酶添加量对水解度的影响

图3 酶添加量和pH对水解度的影响

由图1可以看出，将乳糖酶添加量固定在0水平时，乳糖水解度先是随着pH和水解温度的升高而增加，到达最优点后则开始降低，在二者的交互作用中，温度和pH对响应值的影响作用都很明显。当温度高于45℃和pH低于6.2时，酶基本失活，水解度迅速降低，同理，在低温和高pH条件下，酶活性也不很稳定。

当把pH固定在0水平时，响应值可以达到的最大值为69.25%，如图2所示，在水解温度和酶添加量的交互作用中，水解温度是影响水解度的主要因素，在适当的水解温度条件下，增加酶添加量，可获得较高的水解度。

同样，图3显示的是当水解温度固定在0水平时，pH和酶添加量对乳糖水解度的影响，可见pH对响应值的影响较大，在适当的pH条件下，随着酶添加量的增加，水解度呈增大趋势。

2.3 最优水解条件的确定

综合2.2中的分析，兼顾考虑乳糖酶的使用量和节约能源，将酶添加量控制在0.8～1.2g/kg，水解温度定为30～40℃，再利用Design-Expert软件分析，得到最佳点处 pH6.73，酶添加量 1.03g/kg，水解温度37.26℃，此条件下水解3h，乳糖的水解度可达到66.02%，但比徐宁等人得到的结论［7］偏低，可能是由于乳糖酶存放时间过长，酶活力降低所致。

3 结论

本实验利用响应面方法确定了β-半乳糖苷酶水解乳清中乳糖的最佳水解条件，当乳清pH为6.73，酶添加量1.03g/kg，水解温度37.26℃时，水解3h后可获得乳糖最大水解度为66.02%，而且此时得到的水解液略带奶香，口感香甜，可以作为进一步发酵生产低乳糖乳清饮料的基液。本实验结果不仅为乳糖酶在乳清中的应用提供了理论依据，而且为国内低乳糖乳清饮品的开发开辟了新的途径。

［1］Djuric M，Caric M，Spasenija M，et al.Development of wheybased beverages［J］.Eur Food Res Technol，2004，219（4）：321-328.

［2］赵少华.Maxilact乳品酵母乳糖酶在牛奶和乳清中的应用［J］.食品工业科技，2007，9（5）：44-46.

［3］Vasiljevic T，Jelen P.Production of β-galactosidase for lactose hydrolysis in milk and dairy products［J］.Innovative Food Scienceamp;Emerging Technologies，2001，2（2）：75-85.

［4］Panesar P S.Application of response surface methodology in the permeabilization of yeast cells for lactose hydrolysis［J］. Biochemical Engineering Journal，2008，39：91-96.

［5］Guo Y X，Pan D D.Optimization of hydrolysis conditions for the production of the angiotensin-I converting enzyme（ACE）inhibitory peptides from whey protein using response surface methodology［J］.Food Chemistry，2009，114：328-333.

［6］王辉.低乳糖牛奶生产工艺及乳糖水解率测定方法的研究［D］.东北农业大学，2003.

［7］徐宁，孙波，迟玉杰.以乳清为原料酶法水解乳糖条件的研究［J］.食品科学，2007，28（12）：286-290.

Study on the technology condition of enzymatic hydrolyzing lactose in whey using response surface methodology

XIANG Li-li，JI Ni-na，NIAN Jing-qi，HUO Gui-cheng*
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Using response surface methodology for enzymatic hydrolysis of lactose in whey，the effects of different parameters（β-galactosidase dosage，pH and temperature）on the hydrolysis degree（DH）of lactose were investigated.The optimum technology conditions for enzymatic hydrolysis of lactose in whey were 1.03g/kg β-galactosidase dosage，pH6.73 and 37.26℃.Under these conditions of process variables，DH of the lactose in whey was 66.02%after 3h of treatment.

whey；lactose hydrolysis；β-galactosidase；response surface methodology

TS201.2+3

B

1002-0306（2011）02-0233-03

2010-03-09 *通讯联系人

项丽丽（1984-），女，在读硕士，研究方向：乳品科学。

东北农业大学生物乳业创新团队（CXT007-2）。