不同产地雷公藤药材中总二萜内酯含量的测定

高 丽，聂中标，尚彩玲，王永辉，李艳彦，周 然

（山西中医学院，山西太原030024）

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）系卫矛科（Celastraceae）雷公藤属一年生藤本植物，广泛分布于长江流域以南各地及西南地区，如江西、浙江、安徽、湖南、广东、福建、台湾等地。药用部位为根，具有祛风除湿、活血化瘀、清热解毒、消肿散结、杀虫止血等功效，对肾病综合征、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等多种疾病有较好的治疗效果。但雷公藤有大毒，是近半个世纪以来报道发生中毒事件最多的中药之一。雷公藤主要有效成分为二萜内酯类，包括雷公藤甲素、雷公藤内酯二醇等，其中雷公藤甲素是雷公藤的主要活性物质及主要毒性成分，因此，本实验选择雷公藤总二萜内酯作为检测指标，采用比色法对雷公藤药材进行质量分析研究。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

雷公藤甲素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111567-200502），3，5-二硝基苯甲酸（化学纯，中国五联化工厂，批号：w0040711），KOH（分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂，批号：20080908），层析用中性氧化铝（100目～200目，成都市科龙化工试剂厂，批号：20091001），硅胶G薄层层析（青岛谱科分离材料有限公司，批号：6006），其他试剂均为分析纯。

雷公藤药材分别采自江西、湖南、湖北、广西、福建等地，经山西省药品检验所高天爱研究员鉴定为卫矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.F.的干燥根。

1.2 实验仪器

BS224S万分之一电子天平（德国赛多利斯），BT25S十万分之一电子天平（德国赛多利斯），KQ-300 VDE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），DL-5-B离心机（上海安亭），Cary 50紫外可见分光光度计（美国瓦里安）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取雷公藤甲素对照品1.95 mg，置25 mL容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 供试品溶液的制备［1-2］

取雷公藤粉末（过3号筛）约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入乙醇100 mL，密塞，称定重量，放置过夜，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，以3 000 rpm离心10 min，浓缩上清液，用中性氧化铝拌样，过中性氧化铝柱（湿法装柱，内径12 mm），用50 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液（40滴/min），浓缩至干，用乙醇溶解，移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 Kedde显色剂的配制

根据文献［3-4］报道及预实验，配制2%3，5-二硝基苯甲酸乙醇溶液和2%KOH乙醇溶液，临用前1∶1 混合。

2.4 薄层色谱法鉴定实验

图1 薄层色谱图

按照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）实验，分别取对照品溶液和供试品溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯（5∶3）为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%的硫酸溶液，105℃加热至斑点清晰，置日光下观察，结果见图1。供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上显现相同颜色的斑点。

2.5 测定波长的选择

精密吸取对照品溶液2 mL，加乙醇6 mL，加Kedde显色剂2 mL，摇匀，以相应试剂为空白，在400 nm～700 nm波长范围内扫描，结果表明对照品的最大吸收峰在550 nm波长处，故选550 nm为测定波长。

2.6 稳定性考察

精密吸取对照品溶液2 mL，加乙醇6 mL，Kedde显色剂2 mL，摇匀，以相应试剂为空白，于550 nm波长处，室温下每隔5 min测定吸光度，考察60 min内稳定显色的时间段。结果显示15 min～30 min内吸光度大且稳定，故选显色20 min进行测定。

2.7 线性关系考察

精密吸取对照品溶液 1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，加 7 mL，6 mL，5 mL，4 mL，3 mL，2 mL 乙醇，加 Kedde显色剂 2 mL，摇匀，显色20 min，以相应试剂为空白，于550 nm波长处测定吸光度。以对照品的浓度X（μg/mL）为横坐标，吸光度Y为纵坐标，进行线性回归，其线性范围为 7.8 μg/mL～46.8 μg/mL，回归方程为：Y=0.022X+0.016 6，r=0.999 5。

2.8 重复性试验

取雷公藤粉末6份，各约10 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取2 mL，加6 mL乙醇，2 mL Kedde显色剂，摇匀，显色20 min，以相应试剂为空白，于550 nm波长处测定吸光度，结果雷公藤中总二萜内酯的平均含量（n=6）为0.084 8‰，RSD为1.78%。

2.9 加样回收试验

称取已知含量的雷公藤粉末约5 g，共6份，精密称定，分别精密加入雷公藤甲素对照品0.38 mg，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取2 mL，加6 mL乙醇，2 mL Kedde显色剂，摇匀，显色20 min，以相应试剂为空白，于550 nm波长处测定吸光度，代入标准曲线，计算平均加样回收率（n=6）为96.86%，RSD为2.40%，结果见表1。

表1 加样回收试验结果 （n=6）

2.10 样品含量测定

取样品粉末（过3号筛）各3份，每份约10 g，精密称定，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取2 mL，加6 mL乙醇，2 mL Kedde显色剂，摇匀，显色20 min，以相应试剂为空白，于550 nm波长处测定吸光度，代入标准曲线计算雷公藤总二萜内酯的含量，结果见表2。

表2 雷公藤药材中总二萜内酯的含量测定 （n=3）

3 讨 论

对于雷公藤总二萜内酯的测定，目前普遍采用基于Kedde试剂显色反应原理的比色法［5］。Kedde试剂显色反应原理是在碱性溶液中，内酯环上的不饱和双键转位能形成活性次甲基，形成的次甲基非常活泼，可以和3，5-二硝基苯甲酸等试剂进行缩合反应，氧化生成具有醌式结构的物质而呈紫红色，在可见光区有特征吸收峰［6］，因此本实验采用Kedde显色反应，对雷公藤中含有α，β-不饱和内酯环的雷公藤总二萜内酯进行定量分析。Kedde显色剂由3，5-二硝基苯甲酸和碱性试剂如KOH或NaOH组成。

本实验测得不同产地的雷公藤药材中总二萜内酯的含量变化较大，其中江西产雷公藤总二萜内酯含量最高。目前国内市场上的雷公藤类口服制剂有汤剂、雷公藤片、雷公藤多苷片、雷公藤口服液、雷公藤糖浆等多种剂型，这些制剂多为原药材的乙醇粗提物，仅有雷公藤多苷片是经过初步提纯的，质量良莠不齐，主要有效成分和毒性成分的含量既没有监控也没有测定标准。不同来源的雷公藤药材质量差异较大可能是不同厂家生产的雷公藤制剂中有效成分含量差异大的主要原因。因此，应该尽快建立雷公藤及其制剂的质量控制标准，对其进行监控，通过对药材种植、采收、饮片炮制、制剂生产等多环节控制雷公藤的毒性，同时保证药效，以保证用药的安全性和有效性。

［1］李琰，冯俊涛，史晓燕，等.雷公藤组培产物中雷公藤甲素和总生物碱含量的测定［J］.农药学学报，2009，11（3）：367-372.

［2］阮鸣，魏海婷.三批雷公藤药材真伪的鉴别及其提取方法研究［J］.云南民族大学学报：自然科学版，2010，19（2）：143-145.

［3］施栋磊，朱华旭，潘林梅，等.雷公藤药材中有效部位含量的比较研究［J］.中国新药与临床药理，2009，20（6）：566-570.

［4］陈银芳，徐群志，魏惠珍，等.Kedde比色法测定复方雷公藤片中总内酯［J］.中草药，2008，39（2）：223-225.

［5］王晓琳，黄帅.雷公藤乙酸乙酯提取物的含量测定方法［J］.齐鲁药事，2008，27（8）：471-473.

［6］姚新生，吴立军，吴继洲.天然药物化学［M］.4版.北京：人民卫生出版社，2004.