结缔组织生长因子和金属蛋白酶组织抑制因子-1 RNA干扰靶位的筛选*

蒋玉凤 黄 飞 张建军 刘加群 孙华丽

肝纤维化是多种原因引起的慢性肝损伤所共有的病理学改变，是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成增多、降解不足而在肝内过量沉积的结果[1]。TGF-β及其信号传导途径在肝纤维化发生机制中起着关键作用，TGF-β信号诱导结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF） 的表达而促进ECM的合成，诱导金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）表达，阻断基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）对 ECM 的降解[2～4]。RNA 干扰是目前最有效的基因沉默技术，能特异性抑制靶基因的转录，进而下调相应蛋白水平及功能。RNAi靶序列的选择很关键,所以，RNA干扰实验通常需要针对一个基因设计多个靶序列的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），以找到最有效的 siRNA 序列[5，6]。本研究旨在针对CTGF和TIMP-1目的基因分别设计3条siRNA，通过转染肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）以筛选有效的抑制序列，为进一步研究CTGF和TIMP-1在肝纤维化发生中的作用以及探索肝纤维化的基因治疗奠定基础。

材料与方法

一、细胞与试剂 大鼠HSC-T6由我院中心实验室冻存；新生小牛血清购自杭州四季青公司；RNA抽提试剂TRIZOL购自上海生工公司；CTGF、TIMP-1RNA干扰序列由上海生工公司合成；CTGF、TIMP-1、GAPDH、I型前胶原（Procol-α1）、无关序列（silence）引物由上海博尚生物技术有限公司合成；逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自FINNZYMES公司；转染试剂KeyGenTransIII购自凯基生物科技发展公司；III型前胶原、粘连蛋白、透明质酸放射免疫分析试剂盒购自上海海研医学生物技术有限公司；TGF-β1购自美国Cytokines公司。

二、大鼠CTGF和TIMP-1基因干扰靶位设计 在NCBI Gen Bank数据库中，在线查询大鼠CTGF和TIMP-1基因序列。CTGF基因序列的Accession number为 AF120275；TIMP-1基因序列的Accession number为NM-053819。然后，在晶赛公司网站在线设计RNA干扰靶位，通过计算机软件，各选取3段，同时设计阳性对照（GAPDH/r基因干扰靶位）和阴性对照（无关干扰序列），见表1。

表1 基因靶序列

三、PCR引物的设计 ①大鼠CTGF（预计产物483bp）：上游引物：5’-GCCTCGCCTTGGTGCTCCTCCTCT-3’；下游引物：5’-TGCGGTCCTTGGGCTCATCACAC-3’；②大鼠 TIMP-1（预计产物 308bp）：上游引物：5’-GCGCCCTTTGCATCTCTGG-3’，下游引物：5’-TCGCTGCGGTTCTGGGACTT-3’；③大鼠看家基因GAPDH（预计产物 570bp）：上游引物：5’-CATAGACAAGATGGTGAAGG-3’，下游引物：5’-TCCACAGTCTTCTGAGTGGC-3’；④大鼠 Procol-α1（预计产物409bp）：上游引物：5’-AGCCCCTCAACCCCCAGCCTACTT-3’，下游引物：5’-CCCACCCCACCCCTTCACAGAGAT-3’。

四、dsRNA转染TGF-β1活化的HSC 分组转染已经TGF-β1刺激活化的HSC：每组5μg dsRNA分别与490μl无血清无抗生素的低糖DMEM培养液混匀后，再加入10μl转染试剂KeyGenTrans III，最终获得500μl的转染复合物，加入细胞培养液中，37℃、5%CO2孵育、转染细胞 48h。分组：CTGF-1、CTGF-2、CTGF-3、TIMP-1-1、TIMP-1-2、TIMP-1-3、CTGF-1/TIMP-1-1、CTGF-1/TIMP-1-2、CTGF-1/TIMP-1-3、CTGF-2/TIMP-1-1、CTGF-2/TIMP-1-2、CTGF-2/TIMP-1-3、CTGF-3/TIMP-1-1、CTGF-3/TIMP-1-2、CTGF-3/TIMP-1-3、阴性对照组（no-sense）和空白对照组（不加dsRNA）。每组设3个复孔，取均值。

五、HSC总RNA的抽提与逆转录成cDNA 分别进行细胞裂解和RNA的分离、沉淀、洗脱、再溶解，并逆转录成cDNA。

六、目的基因相对表达量的检测 采用荧光定量 PCR法，反应体系如下：DyNAmo YBRGreenMastermi×25μl，上下游引物各 2μl，cDNA 5μl，灭菌水 16μl，总体积 50μl。各反应管放入荧光定量PCR仪（iCycler，BIO-RAD），按以下条件扩增：94℃，5min→（94℃，30s→60℃，30s→72℃，45s）×40个循环→72℃，10min。在PCR循环第2步72℃时收集荧光信号，由计算机软件自动分析、计算出Ct值。采用比较阈值法[7]计算待测目的基因的相对表达量，设阴性对照目的基因的表达量为1，则所得比值为实验组相对于阴性对照组基因表达量的倍数。然后，按照下列公式计算抑制率。

七、肝纤维化指标检测 收集转染48小时后HSC培养上清液，检测III型前胶原（procollagen type-III，PCIII）、透明质酸（hexadecenoic acid，HA）、粘连蛋白（laminin，LN）含量，使用智能放免测量仪（SN-695B）完成定量分析。

结果

一、RNA干扰对靶基因及其下游产物Procolα1mRNA表达的影响 见表2。

表2 各干扰组对靶基因和procol-α1mRNA表达的抑制作用

二、肝纤维化指标的变化 见表3。

表3 各干扰组PCIII、HA和LN水平（ng/ml）的变化

讨论

TGF-β及其信号转导途径在肝纤维化发生机制中起着关键作用[8～10]。CTGF 和 TIMP-1 是 TGF-β 信号通路之下游分子，前者促进ECM合成，后者抑制ECM降解，在肝纤维化发生过程中发挥协同促进作用。

本实验目的在于采用针对介导HSC活化的关键因子CTGF和TIMP-1的siRNA双重干扰，阻断CTGF和TIMP-1的促肝纤维化形成作用，以探讨肝纤维化的发病机制和防治方法。

我们针对每条目的基因分别设计了3个siRNA干扰候选靶位，分别转染或不同组合后转染经TGF-β1刺激活化的大鼠肝星状细胞，结果显示每组CTGF-dsRNA可高效抑制CTGF及其下游产物procol-α1的表达，每组TIMP-1-dsRNA也可高度抑制TIMP-1及其下游产物procol-α1的表达，但不同的干扰靶位干扰效果有较大差异。CTGF和TIMP-1不同靶位RNA联合干扰后，对 CTGFmRNA、TIMP-1mRNA 和 procol-α1mRNA 表达的抑制效果较单独干扰的抑制效果更强，说明联合应用针对一个基因的多个siRNA，或同时干扰几个基因，阻断其生命周期的多个环节，能产生协同作用，并有可能减少由于点突变造成的对iRNA治疗的耐受。另外，我们发现联合干扰后，CTGF-3/TIMP-1-3组对CTGFmRNA和TIMP-1mRNA的抑制作用最强，而对procol-α1mRNA的抑制作用最强的却是CTGF-2/TIMP-1-3组，可能与iRNA抑制的靶基因有关，尚需以后做进一步的研究证实。肝纤维化指标检测也提示CTGF-3组和TIMP-1-3组单独抑制PC III型、HA、LN最佳，而联合干扰时，以CTGF-2/TIMP-1-3组对III型胶原、HA、LN的抑制作用最强。

由于机体的复杂性，ECM的合成和降解还受到许多因素的影响。因此，应进一步观察CTGF和TIMP-1与TGF-β信号转导的关系，不仅有助于进一步阐明CTGF和TIMP-1在肝纤维化发生中的作用机制，也可能为肝纤维化的防治研究提供重要的途径。

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