DNS法对三七总多糖含量测定

熊艺花，李 婧，黄 松，袁 捷，赖小平

（1.广州中医药大学，广东 广州510006；2.东莞广州中医药大学 中医药数理工程研究院，广东 东莞523808）

中药三七为五加科植物人参三七（Panax notoginseng（Burk.）F H.Chen）的干燥根，主产于云南、广西等地，野生或栽培，其性温，味甘、微苦，具有活血化瘀、消肿定痛的功效［1］，是我国传统名贵中药材，目前多用于冠心病、心绞痛等心血管系统疾病的防治。近年来，通过对三七多糖的药理研究，发现三七多糖具有增强免疫功能等活性作用［2－3］。目前多糖的含量测定方法有苯酚－硫酸比色法、蒽酮－硫酸比色法、DNS法等。崔秀明等［4］运用苯酚－硫酸比色法测定了三七中总多糖成分的含量，但本实验发现苯酚－硫酸法在实验过程中结果不稳定，另外，硫酸具有较强的腐蚀性，给实验操作带来极大不便。DNS法操作简单，结果稳定。本文采用DNS法对三七中总多糖进行含量测定，建立三七总多糖的含量测定方法，以期为系统评价三七药材的质量提供一定的资料。

1 材料

1.1 仪器

Aquapro艾科浦u系列纯水机，CP225D十万分之一电子天平（德国sartorius公司）；KQ5200DA型数控超声清洗器（昆山市超声仪器公司）；Thermo Helios r紫外分光光度仪。

1.2 药材与试剂

D－无水葡萄糖对照品（批号：1108333－200503，购于中国药品生物制品检定所）；三七饮片（批号：090921、091001、091125，购于广州致信饮片公司，由广州中医药大学赖小平研究员鉴定）；3，5－二硝基水杨酸，NaOH溶液，酒石酸钾钠，苯酚，亚硫酸钠，HCl溶液等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 DNS试剂的配制［5］

称取3，5－二硝基水杨酸3.15g，溶于131mL 2mol·L－1NaOH溶液中，再将其加入到250mL含91.0g酒石酸钾钠的热水溶液中，搅拌使其溶解，然后加入2.5g苯酚和2.5g亚硫酸钠，充分搅拌，溶解，冷却后定容至500mL棕色容量瓶中储存，室温放置1周稳定后使用。

2.2 三七供试品溶液的制备

2.2.1 三七总多糖样品制备

精密称取三七粉末5.0g，置250mL容量瓶中，加入蒸馏水200.0mL，超声提取2h，冷却至室温，加蒸馏水至刻度，4 000r·min－1离心10min。精密移取上清液100.0mL，置250mL茄形瓶中，减压回收至干，用蒸馏水少量多次将其溶解至10mL容量瓶中，加水定容至刻度。将浓缩液用40.0mL无水乙醇洗至100mL三角锥形瓶中，充分振摇混匀，置冰箱中冷藏放置过夜。将上述溶液转至离心管中4 000r·min－1离心5min，残渣用80%乙醇洗涤4次，每次10mL。将上述残渣用蒸馏水溶解至100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，即得总多糖样品。每个样品平行3份。

2.2.2 三七总多糖样品水解

精密移取上述三七多糖样品溶液20.0mL，置三角锥形瓶中，加入10mL 6mol／L HCl溶液（现配），封口，于沸水浴上加热30min，取出冷却至室温，用6mol／L NaOH溶液调pH值至8.0，4 000rpm离心5min，残渣用水洗涤，上清液与水洗涤液一并置50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀即得三七多糖水解液样品。

2.3 测定波长的选择

2.3.1 对照品溶液显色扫描

精密移取葡萄糖对照品溶液0.8mL置具塞试管中，加水至2.0mL，加入1.5mL DNS试剂，摇匀，于沸水浴中加热5min，取出后迅速冷却，随行以2.0mL蒸馏水作空白，用紫外－可见分光光度计于200～800nm进行全波长扫描，结果见图1。

图1 葡萄糖溶液显色UV扫描

2.3.2 三七供试品显色扫描

精密移取三七多糖水解液样品2.0mL置10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，精密移取上述溶液0.3mL置具塞试管中，加蒸馏水至2.0mL，加入1.5mL DNS试剂，摇匀，于沸水浴中加热5min，取出后迅速冷却，随行以2.0mL蒸馏水作空白，用紫外－可见分光光度计于200～800nm进行全波长扫描，其吸收曲线见图2。

图2 三七供试品显色UV扫描

对比以上两个样品扫描图可知，二者的最大吸收峰一致，均在510nm处左右，因此选择510nm为检测波长。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的绘制

精密称取干燥恒重D－无水葡萄糖对照品适量，加水溶解使成400.0mg／L，精密移取葡萄糖对照品溶液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL，置具塞试管中，分别加水至2.0mL，加入1.5mL DNS试剂，摇匀，于沸水浴中加热5min，取出后迅速冷却，以第一份样品作空白，于510nm下测定其吸光度，每个样品浓度平行3份，以每3.5mL溶液中所含的葡萄糖质量（mg）为横坐标，以其平均吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程：Y＝5.859X－0.355 9（r＝0.999 2）。结果表明，D－无水葡萄糖溶液在0.117 6～0.313 6mg／3.5mL范围内与吸光度有良好的线性关系。

2.4.2 精密度试验

精密吸取对照品溶液0.5mL，按标准曲线制作方法测定吸光度，重复测定6次。平均吸收度为0.744，RSD为0.21%，结果表明精密度良好。

2.4.3 稳定性实验

精密称取三七样品5g，按“2.2”项下操作制备溶液，依法显色，显色后分别于0、5、10、15、20、25、30min测定其吸光度，平均吸收度为0.835，RSD为1.66%。结果表明样品溶液在30min内稳定。

2.4.4 重现性试验

取三七样品6份，按“2.2”项下操作制备溶液，依法测定，平均含量为9.30%，RSD为1.9%，结果表明重现性良好。

2.4.5 回收率试验

取已知含量的样品5份，每份取约2.5g，精密称定，每份样品分别加入精密称取的葡萄糖对照品0.1mg，按“2.2”项下方法制备供试品，按“2.4.1”项下方法操作，算得样品的平均加样回收率为98.87%，RSD为2.6%，表明本方法准确度良好。结果见表1。

表1 回收率测定结果

2.5 三七供试品总多糖含量测定

精密移取不同等级的三七多糖水解液样品1.0mL（根据实验结果调整取样量），置具塞试管中，加水至2.0mL，加入1.5mLDNS试剂，摇匀，于沸水浴中加热5min，取出后迅速冷却，随行以2.0mL蒸馏水作空白，用紫外－可见分光光度计于510nm测定吸光度。按公式1计算，结果见表2。

多糖含量%＝m／（m样品／250×V多糖／100×V水解液／50×1000）×0.9

其中，m样品为样品取样量，V多糖为水解时多糖取样体积，V水解液为显色时所取水解液体积；多糖水解成单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，故在计算单糖含量时需乘以0.9校正。

表2 三七样品多糖含量测定结果

3 讨论

多糖并不具有还原性，跟DNS无法反应，因此需要对总多糖溶液进行水解后再用DNS法显色测定其吸光度，此时测定的为三七中总糖含量；同时，水提醇沉法可以将三七中的还原糖沉淀出来，因此需先对三七多糖溶液用DNS显色后测定其吸光度，此时测定的为三七中还原糖含量；总糖含量减去还原糖含量即为三七中多糖含量。在试验中对未水解的多糖进行显色测定后发现其吸光度极低，对结果影响不大，因此本实验没有对其进行测定。多糖的含量测定方法有苯酚－硫酸法［5］、硫酸－蒽酮法［6］、3，5－二硝基水杨酸法等。本文采取了DNS法测定三七总多糖的含量，对不同批次三七中总多糖进行含量测定，以期为系统评价三七药材的质量控制提供资料。

［1］国家中医药管理局.中华本草［M］.上海科学技术出版社，1999：839－849.

［2］GAO H，WANG F，LIEN EJ.Trousdale MD.Immuno stimulating polysaccharides from Panax notoginseng［J］.Pharm Res，1996，13（8）：1196.

［3］陈新霞，顾呈华，杨明晶，等.三七多糖对小鼠免疫功能调节的研究［J］.江苏预防医学，2007，18（3）：10－12.

［4］崔秀明，徐珞珊，王强，等.三七糖类成分的含量及其变化［J］.现代中药研究与实践，2003，7（增刊）：21－24.

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［6］李小凤，程荷凤.广佛手中总多糖含量的分光光度法测定［J］.中成药，2004，26（10）：5－6.

［7］姜曼花，邱细敏，刘胜姿，等.白背三七多糖的提取纯化及含量测定［J］.时珍国医国药，2008，19（9）：2148－2149.