金樱根多糖含量测定及提取工艺优选

郭巧玲，田素英

（1.广东省新兴中药学校，广东 新兴527400；2.广东药学院 中山校区，广东 中山528458）

金樱根为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx.的干燥根、根皮，最早入药记载见于《日华子本草》，为临床常用中药，有清热解毒，凉血活血，祛瘀止痛，固精涩肠等功用，临床应用广泛，已被制成多种制剂，临床效果良好［1］。多糖类化合物是多种中草药的有效成分之一，具有多种生物活性。近年来研究显示高等植物中所含多糖具有提高和恢复机体免疫功能、抗心肌缺血、抗应激、抗肿瘤等［2］功用。本实验对金樱根多糖提取工艺与含量进行研究，为开发利用金樱根多糖，制定其质量标准提供科学依据。

1 主要仪器与材料

KQ－500型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TE52CS旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；恒温水浴锅B－220（上海亚荣生化仪器厂）；MV1102紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）。金樱根（批号：090210、090901、1006284，均经广东药学院房志坚副教授鉴定为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx.的干燥根）；（＋）葡萄糖（AR，天津市津东天正精细化学试剂厂）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定

（1）对照品溶液的制备。精密称取105℃恒温干燥至恒重的葡萄糖60mg，用蒸馏水溶解并定容至100mL。摇匀，静置。

（2）供试品溶液的制备。取金樱根粗粉2g，加石油醚—乙醇（1∶2）混合液150mL，置250mL锥形瓶中，超声20min，过滤，取药渣挥干后，置锥形瓶中，加0.5%氢氧化钠水溶液100mL，超声20min。加稀盐酸至提取液呈中性，置100℃水浴加热20min，过滤，滤液加纯水定容至100mL。

（3）最大波长测定。分别精密移取标准溶液和样品液各0.5mL，分别置20mL容量瓶加纯水定容。精密吸取各溶液2mL置具塞试管，分别加入4%苯酚水溶液1mL，摇匀后迅速加入浓硫酸7mL，摇匀，放入40℃温水水浴30min，取出，冷却10min，于400～520nm处波长扫描，读取吸光度值，确定吸收峰，得到最大波长为485.0nm（见表1）。

表1 样品最大波长紫外测定结果

（4）标准曲线制备［3］。精密移取对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL，分 别 置 于20mL容量瓶，加纯水定容。精密吸取各溶液2mL置具塞试管，按最大波长测定法于最大波长485nm处，以蒸馏水为空白，测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，对照品溶液浓度C（mg／mL）为横坐标制作标准曲线。得标准曲线回归方程为Y＝7.784 2X＋0.000 9，r＝0.999 3。结果表明，在溶液浓度为0～0.05mg／mL范围内测定葡萄糖吸光度呈良好线性。

（5）显色稳定性考察。精密移取对照品溶液和供试品溶液各0.8mL，分别置20mL容量瓶加纯水定容。以冷水水浴10min，开始为0min，每隔10min记录1次。RSD为1.58%（n＝9），结果表明，在10～90min区间内显色稳定性良好（见图1）。

（6）精密度考察。精密移取对照品溶液0.2mL置于20mL容量瓶，加纯水定容，测定吸光度值。结果RSD%为0（n＝5），结果表明该精度良好。

（7）多糖含量测定。按上述制备方法取三批次样品制成供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，分别用纯水定容至20mL。按标准曲线中苯酚—硫酸显色法显色，并记录吸光度。代入标准曲线中计算总含糖量（124.593 8±2.150 6）mg。

图1 显色稳定性考察结果

（8）加样回收试验。精密称取已知多糖含量的粗多糖溶液1mL 3份，依次加入不同量的葡萄糖标准贮备液，按上述操作方法测定供试品溶液的吸光度值，计算多糖回收率为94.70%，RSD为2.51%（n＝6）。

2.2 提取工艺的优选

2.2.1 单因素考察（超声提取温度60℃，提取时间20min）

氢氧化钠溶液浓度选择：精密称量约1g／份的金樱根粗粉共5份，按上述方法制备溶液，分别以浓度为1%、1.5%、2.0%、2.5%、3%的氢氧化钠为提取液50mL超声提取，再用100℃水浴提取2h，过滤。吸取各滤液0.5mL，用纯水定容至20mL。测定含糖量。结果表明，氢氧化钠溶液浓度对金樱根多糖的提取结果有影响，且2.5%浓度的氢氧化钠提取结果较好。

料液比选择：精密称量约1g／份的金樱根粗粉共5份，按上述方法制备溶液，分别以料液比为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，浓度为2.5%的氢氧化钠溶液为提取液进行超声提取，再用100℃水浴提取2h，过滤。吸取各滤液0.5mL，用纯水定容至20mL。测定含糖量。结果表明，随着料液比的提高糖的提取量也提高。

提取温度选择：精密称量约1g／份的金樱根粗粉共5份，按上述方法制备溶液，以2.5%氢氧化钠溶液50mL超声提取后，再分别60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴提取2h，过滤。吸取各滤液0.5mL，用纯水定容至20mL。测定含糖量。结果表明，提取温度对多糖的提取结果有影响，且随着水浴温度的提高，糖含量也相应提高。可能是因为随着温度的提高，金樱多糖的溶解度不断升高，所以，提取温度越高，提取的多糖的量也就越多。由于水浴的最高温度为100℃，故正交实验考察最佳提取条件时不再考察温度，直接用100℃进行水平提取。

提取时间选择：精密称量约1g／份的金樱根粗粉共5份，按上述方法制备溶液，以2.5%氢氧化钠溶液50mL超声提取后，再分别0.5h，1h，1.5h，2.0h，2.5h，100℃水浴提取，过滤。吸取各滤液0.5mL，用纯水定容至20mL。测定含糖量。结果表明，2.5h糖含量较多，有可能是在水浴过程中多糖链断裂成单糖碎片，提高了多糖的溶解度。

2.2.2 正交试验

根据金樱根的提取性质考察了氢氧化钠浓度、料液比、提取温度和提取时间4个因素，并结合单因素试验结果，设置3因素3水平正交试验。根据因素水平表，以糖总含量为评价指标，采用L9（33）安排试验，结果见表2。

表2 正交试验优选因素水平与结果

表3 方差分析

实验结果表明，对金樱根多糖含量结果的影响因素显著性顺序为：料液比＞提取时间＞氢氧化钠浓度。金樱根多糖的提取最优工艺为：料液比1∶90，提取时间1h，氢氧化钠浓度为2.5%。

3 讨论

（1）本实验同时采用单因素与正交试验法优选提取工艺，结果获得的最佳提取工艺条件为提取液氢氧化钠浓度为2.5%，料液比为1∶90，100℃水浴提取1h。单因素考察的结果表明，料液比、提取温度、提取液浓度和提取时间均对提取结果有影响，且在各因素所选的5个水平基础上，各因素对结果影响的显著性顺序为：料液比＞提取温度＞提取时间＞氢氧化钠浓度。

（2）本实验采用超声提取和水浴提取相结合，实验结果表明采用此提取方法提取时间对提取结果影响较小，可在较短时间内提取完成。与传统的提取方法中20h以上的回流提取时间相比，大大缩短了提取时间。且超声提取和水浴提取较简便安全，为提取金樱多糖的较佳提取方法。

［1］黄泰康.现代本草纲目［M］.上卷.北京：中国医药科技出版社，2001：61.

［2］吴梧桐，高美凤，吴文俊，等.多糖的抗肿瘤作用研究进展［J］.中国天然药物，2003，1（3）：15.

［3］任浩娜.中药北沙参多糖与单糖组成和含量测定方法研究［D］.沈阳：沈阳药科大学，2008.