SIRT1在NMDA诱导的兴奋性神经毒中的保护作用1）

秦花萍，司沛沛，杨小荣，张 策

谷氨酸是中枢神经系统重要的神经递质，介导各种兴奋性突触传递。在胚胎期神经发育、成年脑的各种兴奋性突触传递、突触的可塑性等方面发挥重要作用［1］。然而，谷氨酸在突触间隙的过度聚集可引起神经元损伤甚至死亡，被称为兴奋性神经毒。兴奋性神经毒参与多种神经病理过程，如脑缺血损伤和各种神经退行性疾病等。而兴奋性神经毒模型是最常用（被普遍公认）、最具毒性（既可引起坏死，也可引起凋亡）、损伤机制最复杂（涉及氧化应激、线粒体功能障碍、细胞坏死及凋亡等）、最具临床意义（兴奋性神经毒参与了几乎所有神经病理过程，如脑缺血损伤，各种神经退行性疾病等）的一个神经损伤模型［1，2］。

沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）作为一种依赖于烟碱腺嘌呤二核苷酸（nicotine－amid adenine dinucleotide，NAD）的去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），广泛存在于哺乳动物细胞质和细胞核中。SIRT1可以作用于组蛋白和非组蛋白使其去乙酰化，从而在多种生物活动过程中发挥重要作用，包括参与基因转录、物质代谢、胰岛素分泌、血管生成以及细胞衰老过程的调节［3－7］。近年研究发现，SIRT1具有明显的神经保护作用。但SIRT1在N－甲基－D－门冬氨酸（N－methyl－D－aspartate，NMDA）诱导的兴奋性神经毒中是否发挥保护作用尚不明确。因此本研究采用NMDA（100 μmol／L，2h）诱导的兴奋毒细胞模型，应用细胞计数试剂盒－8（CCK－8）分析，乳酸脱氢酶 （LDH）检测以及 Calcein－AM 和 PI双染等方法检测细胞损伤，同时使用SIRT1激活剂白藜芦醇（Resveratrol，RSV）和 SIRT1抑制剂 Sirtinol，观察 SIRT1在NMDA介导毒性过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 Neurobasal，B27添加剂购自Gibco，细胞计数试剂盒－8购自Dojindo，LDH试剂盒购自南京建成生物工程研究所，SIRT1激活剂白藜芦醇（Resveratrol，RSV）和SIRT1抑制剂Sirtinol购自Sigma。1.2 方法

1.2.1 原代皮层神经元培养 取新生1d～3d的小鼠，常规手术，分离制成小鼠皮层单细胞悬液。细胞悬液经1 000g离心5 min，弃上清，用培养液重悬细胞，按5×104个／mL的浓度，在37℃、5%CO2的条件下进行培养。

1.2.2 NMDA毒性诱导 采用 NMDA（100μmol／L）和Gly（10μmol／L）与培养神经元共孵育2h，再进行后续的细胞活力检测。SIRT1激活剂白藜芦醇（Resveratrol，RSV）在NMDA诱导之前预孵育12h，SIRT1抑制剂Sirtinol在白藜芦醇孵育前2 h加入。

1.2.3 CCK－8法 将细胞培养在96孔培养板上，经NMDA进行毒性诱导后，继续培养24h，在每孔加入10μL的CCK－8，再继续培养2h，最后用酶标仪测定490nm吸光度值。

1.2.4 LDH检测 将细胞培养在6孔培养板上，经NMDA毒性诱导后，继续培养24h（即NMDA开始作用后的24h），收集培养液进行LDH活性的检测。

1.2.5 Calcein－AM和PI染色 将细胞培养在6孔培养板上，经NMDA毒性诱导后，继续培养24h（即NMDA开始作用后的24h），在盖玻片上滴加Calcein－AM和PI溶液，37℃下孵育20min，PBS洗涤两次。随后用共聚焦显微镜（Olympus，FV21000）在激发波490nm和发射波515nm条件下拍摄照片，并进行细胞计数。

2 结 果

2.1 RSV对NMDA引起的细胞活力下降的作用观察 预先应用SIRT1抑制剂Sirtinol（10μmol／L）与神经元预孵育2h，之后加入SIRT1激活剂RSV（25μmol／L）再孵育12h，采用CCK－8检测细胞活力。结果显示，RSV可有效抑制NMDA引起的细胞活力下降，使细胞活力恢复31.92%（P＜0.05）；Sirtinol可以有效阻断RSV使细胞活力恢复的作用。详见图1。

图1 RSV和Sirtinol对NMDA引起细胞活力下降的影响

2.2 RSV对NMDA引起的LDH释放的作用观察 在进行LDH的实验观察中发现，与对照组相比NMDA组的LDH水平增高了116.03%（P＜0.05）；RSV（25μmol／L）使 NMDA诱导释放的LDH减少27.34%（P＜0.05）；Sirtinol（10μmol／L）取消了RSV减少LDH释放的作用。MK－801完全阻断NMDA的作用。详见图2。

图2 RSV对NMDA引起的LDH释放的作用观察

2.3 RSV对NMDA引起的活细胞下降的作用观察 在利用Calcein－AM和PI免疫组织化学双染进行的活细胞标记的实验观察中发现，NMDA引起存活神经元的数量明显减少，约为对照组的53.37%（P＜0.05）；与 NMDA组相比，RSV（25μmol／L）使活细胞数目增加18.9%（P＜0.05）；同时 Sirtinol（10 μmol／L）抑制了RSV使活细胞数目增多的作用；此外 MK－801完全阻断NMDA的作用。详见图3。

图3 RSV对NMDA引起的活细胞下降的作用观察

3 讨 论

谷氨酸作为中枢神经系统一种重要的神经递质，当过度激活突触后膜NMDA受体时，使胞外的Ca2＋内流引起一系列Ca2＋依赖的重要事件，如各种蛋白酶及蛋白激酶激活、过度产生的自由基，这些因素共同作用，使神经元的结构和功能受到破坏，直到细胞死亡，产生兴奋性神经毒效应［8］。

大约70多年前，人们就发现限制热量摄入可以延长大鼠寿命，后来在线虫、蠕虫、果蝇、芽殖酵母等物种中发现了同样的现象［9］。此后的研究证实，热量限制（calorie restriction，CR）延长酵母及啮齿动物寿命，推迟哺乳动物年龄相关的疾病如癌症、动脉粥样硬化及糖尿病的发生，是通过增加去乙酰化酶Sirtuin活性而起作用。存在于哺乳动物体内的这类酶被称作Sirtuins家族，是一种依赖于烟碱腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶。其中SIRT1是SIRTUINS家族中研究最为深入的一个成员。现有的研究提示，CR延长哺乳动物寿命的机制至少部分通过激活SIRT1。由于SIRT1基因的高度保守和CR延长寿命的广泛性，推测在人类激活SIRT1可能也有延长寿命的作用。SIRT1可以作用于组蛋白和非组蛋白使其去乙酰化，从而在多种生物学过程中发挥重要作用，包括参与基因转录、物质代谢、胰岛素分泌、血管生成、神经保护以及细胞衰老过程的调节［3－7］。

在猴的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）动物模型中，高表达SIRT1能减少脑内的β淀粉样蛋白（amyloid－β，Aβ），且脑内Aβ含量与同一区域的SIRT1含量呈负相关［10］。体外研究表明，SIRT1对诸多底物如p53、FOXOs、Ku70、PGC－1α、TAFI68、P300、PCAF等均具有很强的去乙酰化作用。从这些去乙酰化底物的生理作用推测，SIRT1可能参与调控细胞凋亡、细胞周期、基因转录和物质代谢等过程［11］。相应的实验观察显示，SIRT1可通过使p53特异位点的赖氨酸残基发生去乙酰化作用从而负性调节其活性，使细胞免于凋亡，继续分裂生长［12］；通过使FOXO3a以及其他forkhead家族成员发生去乙酰化作用抑制其转录调控作用，起到促存活抗凋亡的作用［13］；通过对DNA修复蛋白Ku70的去乙酰化作用抑制Bax介导的细胞凋亡［14］。另外，SIRT1也能通过抑制NF－κB的活性，拮抗Aβ对神经元的损伤作用［15］。Okawara等［16］的研究表明，白藜芦醇可以减少由神经毒素（MPP＋）诱导的多巴胺能神经元毒性作用，并且可能是通过激活SIRT1发挥的保护作用。在应用Wallerian慢性退化模型（Wlds）的研究发现，SIRT1对神经元的损伤亦有保护作用。当抑制SIRT1活性后，神经元损伤加剧，而用白黎芦醇激活SIRT1后，神经元的损伤明显减少［17］。此外，SIRT1还可能参与调节物质代谢，如SIRT1通过对PGC－1α的去乙酰化，激活肝脏糖异生抑制糖酵解［18］；还能抑制过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR－γ），可以在热量摄入减少的情况下，促进脂肪动员［19，20］。上述结果提示，SIRT1可能通过调节多种转录调节因子的活性，一方面参与调节细胞在应激条件下的存活与死亡的平衡，另一方面参与代谢的调节。总之，作为一种进化上相对保守的蛋白，SIRT1发挥了一些最为基本而广泛的蛋白修饰功能，从而参与能量代谢调节过程，保持基因组的稳定性，因而使SIRT1具有广泛的细胞保护功能，同时具有延缓衰老及延长生命的作用。

本实验中利用NMDA诱导的兴奋性神经毒模型，观察SITR1在NMDA诱导的兴奋性神经毒中的保护作用。为观察SIRT1可能具有的神经保护作用，应用了SIRT1的激动剂RSV。RSV是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。广泛存在于葡萄、松树、虎杖、决明子和花生等天然植物或果实当中，具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能，因而引起学者的高度重视［21］。研究发现，白藜芦醇可以在多种生物体内模拟CR的作用，因此被认为是CR的模拟物。目前，在进行SIRT1的作用观察过程中，普遍使用RSV作为其激动剂。本实验结果显示，利用SIRT1激动剂RSV能够拮抗NMDA诱导的神经毒性作用，表现为细胞活力增加、LDH释放减少，同时利用Calcein－AM和PI染色观察到活细胞数明显增加。而SIRT1抑制剂Sirtinol能够阻断RSV对NMDA损伤的抑制效应（保护效应），说明RSV的保护作用是通过活化SIRT1而实现的。

本实验研究表明，在NMDA引起的神经毒过程，SIRT1的作用可能受到抑制，由此参与神经损伤；而激活SITR1可发挥神经保护作用。NMDA兴奋性神经毒参与多种神经病理过程，如脑缺血损伤和各种神经退行性疾病等［1，2］。

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