转化医学真菌学实例——直接提取DNA鉴定菌种及体外药敏试验指导诊治面部难辨认癣

康道现 冉玉平 尹斌 代亚玲

(四川大学华西医院1.皮肤性病科;2.实验医学科，成都 610041)

面部难辨认癣极易误诊误治［1-2］。传统诊断方法主要靠真菌镜检及培养等。镜检能明确真菌感染但不能鉴定菌种，培养鉴定耗时较长。我们采用皮损处鳞屑直接做分子生物学菌种鉴定，及早明确菌种，待培养菌落长出后做分子生物学鉴定进行验证，并做体外药敏实验指导临床用药。

1 临床资料

患者女，56岁，因面部红斑、鳞屑就诊。6个月前面部出现红斑，瘙痒伴烧灼感，自用多种外用药(药名不详)无效，皮损面积逐渐扩大，边界不清，表面覆有鳞屑，有烧灼感。2周前在院外诊断"面部皮炎"，经抗过敏治疗(具体不详)无效。查体见面部对称性大片红斑，边界欠清晰，表面大量糠样鳞屑(见图1)，触之粗糙。颈部耳后淋巴结无肿大，肝、肾功无异常。无其他基础疾病及系统使用免疫抑制药物史。

2 实验室研究

2.1 直接镜检

胶带粘取病变部位鳞屑，加10%KOH后直接镜下观察，可见大量有隔菌丝(见图2)。

2.2 鳞屑标本收集处理和PCR-测序

刮取面部鳞屑 (体积至绿豆大小，约重0.01 g)于1.5 mL离心管中［3-4］，加入自制溶角质液 1 mL处理后1 000 r/min离心1 min，弃上清液。加入1 mL无菌蒸馏水充分混匀，1 000 r/min离心1 min，弃上清液，重复洗涤1次。采用Bioflux真菌DNA提取试剂盒 (北京博迈斯生物科技有限公司)提取沉淀DNA，方法参照试剂盒说明书。以真菌rDNA基因保守区为靶目标，采用真菌通用引物ITS1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和 ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇)，扩增所提取真菌DNA的ITS区。反应体系:模板DNA 21 μL，引物各2 μL，2×Pfu PCR寡核苷酸混合物 Master Mix 25 μL。反应条件:94℃ 2 min，94℃ 30 s，47℃ 15 s，72℃ 1 min，共35 个循环，最后72℃ 10 min;PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后Gold View染色验证，约600 bp(见图3)。将PCR扩增产物送美吉生物基因公司测序，结果登录 GenBank进行Blast比对，与万博节皮菌 (趾间毛癣菌有性期)Arthrodermavanbreuseghemii(登录号EU683894)［5］18 s rDNA 部 分 序 列 碱 基 一 致 性99%、ITS全序列、28 s rDNA部分序列碱基一致性99%(登录号JF775847)。

2.3 培养及鉴定菌种

将部分鳞屑接种于沙堡弱琼脂培养基(SDA)，28℃培养7 d见淡黄色丝状菌落长出 (见图4)。挑取少量菌落做钢圈小培养，镜下观察可见大量分隔菌丝和小分生孢子，可见棒状大分生孢子 (见图5)［6］。采用Bioflux试剂盒提取培养菌落真菌DNA。以真菌rDNA基因保守区为靶目标，用真菌通用引物ITS1和ITS4，扩增ITS区。反应体系:模板 DNA 4 μL，引物各2 μL，2 × Pfu PCR 寡核苷酸混合物Master Mix 25 μL，无菌双蒸水补足50 μL。反应条件同上。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后Gold View染色验证，约600 bp。送测序后Blast比对，与万博节皮菌 (趾间毛癣菌有性期)Arthrodermavanbreuseghemii(登录号EU683894)［5］18 s rDNA 部 分 序 列 碱 基 一 致 性99%、ITS全序列、28 s rDNA部分序列碱基一致性99%(登录号JF736844)，与从鳞屑提取DNA经PCR扩增后测序结果一致。

2.4 体外药敏试验

挑取培养菌落溶于无菌蒸馏水后充分混匀，调浊度至0.5～1麦氏浊度，将菌悬液均匀涂布于SDA培养基平板表面制作含菌平板，在此培养基上等距打3孔，分别注入等量市售成品药物2%酮康唑乳膏 (金达克宁，西安杨森)、1%特比萘芬乳膏 (兰美抒，北京诺华)、1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏 (必亮，重庆华邦)，置28℃培养7 d［7］。观察各药膏孔周围抑菌圈大小并记录其直径，同时做2个平板，取2个平板实验结果的抑菌圈直径的平均值和标准差。结果示含上述3种抗真菌乳膏孔周围的抑菌圈直径依次分别为(29.5±3.54)mm、(65.00 ±4.24)mm、(78.00 ±5.67)mm(见图 6)。

3 诊断与治疗

根据患者皮损特点及真菌直接镜检结果，临床诊断为面部难辨认癣，立即给予口服特比萘芬 (兰美抒，北京诺华)250 mg/d，外洗2%酮康唑洗剂(采乐，西安杨森)1次/d，外用1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏(必亮，重庆华邦)1次/d。2周后患者复诊依据抗真菌药物抑菌实验结果继续口服特比萘芬及外用1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏治疗，患者每次复诊时行真菌直接镜检和培养，培养阳性继续治疗，总疗程5周，镜检和培养阴性，鳞屑消失，皮损治愈 (见图7)。

图1 初诊时患者面部皮损 图2 KOH直接镜检可见大量有隔菌丝(×400) 图3 上泳道为菌落PCR结果，下泳道为鳞屑PCR结果，大小均为600 bp左右 图4 鳞屑接种于沙堡弱培养基，28℃培养7 d见淡黄色丝状菌落生长。连续培养5周，第1、2、3、4周为阳性，第5周转阴 图5 小培养镜下见葡萄串状小分生孢子和棒状大分生孢子(×400) 图6 体外药敏实验:顺时针方向依次为2%酮康唑乳膏、1%特比萘芬乳膏、1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏 图7 治疗5周后皮损(注:图中红字显示所需时间)Fig.1 Facial tinea incognito before treatment Fig.2 A bound of septate hyphea by KOH examination Fig.3 The upper track:PCR of the scales，the lower track:PCR of isolated colonies Fig.4 Colonies on Sabouraud dextrose agar after 7 days at 28℃.The first 4 weeks are positive and the fifth week becomes negative Fig.5 Slide culture:microconidia and cigar-shaped macroconidia(×400)Fig.6 In vitro susceptibility test:2%ketoconazole，1%terbinafine and 1%naftifine-0.25%ketoconazole clock wisely Fig.7 Cured after 5 weeks treatment(The red words show the time needed)

4 讨 论

趾间毛癣菌在须癣毛癣菌复合体中最为常见，近来经分子系统学分析，其有性期对应为万博节皮菌。感染人类时常累及头皮、破损皮肤和须部等皮肤，可致手足癣、体股癣、头癣、须癣和甲癣，多为散发性感染［8］。咪唑类的酮康唑及丙烯胺类的萘替芬、特比萘芬的外用制剂用于治疗多种皮肤癣菌及念珠菌感染性皮肤病。与丙烯胺类相比，酮康唑对皮肤癣菌抗菌效果较差，临床上有病例存在耐药情况。丙烯胺类对皮肤癣菌效果较好，但对某些念珠菌效果较差［9］。及时准确的鉴定菌种以及药敏试验对于指导临床用药意义重大。采用传统的培养法鉴定趾间毛癣菌耗时长，至少需要7～14 d。而采用鳞屑直接提DNA鉴定在48～72 d内即可完成。为从鳞屑中直接提取致病真菌DNA，先用溶角质液处理，离心去除角质溶解物以充分暴露菌体，便于释放真菌DNA。再以无菌蒸馏水洗涤两次，排除处理液对提取DNA的干扰。从鳞屑中直接提取的真菌DNA含量较来自纯培养菌落的DNA少，PCR时以含DNA的溶液完全替代双蒸水，从纯培养时的4 μL加至21 μL以扩增出能满足测序所需的产物。

从鳞屑中直接鉴定菌种的非培养法没有菌株，不能做体外药敏实验。因此培养法和非培养法相结合，先行非培养法明确致病菌种，待菌落长出后做PCR-测序进行验证，并做体外药敏实验验证依据镜检阳性的经验性治疗是否为最佳组合，为进一步调整用药提供依据。直接从鳞屑提取DNA做分子生物学鉴定与培养菌株提取的DNA做分子生物学鉴定结果可相互验证，结合成品抗真菌药物的药敏试验，既能提早明确致病菌种为经验性治疗选药，又能筛选敏感药物确定是否需调整药物，定期取材培养可确定疗程，为何时停药提供客观指标。内服药物的体外药敏实验并不能完全模拟体内过程，有一定局限性，而直接将外用药物加入打孔的培养基内，根据抑菌圈的大小直接判断其抗菌活性强弱对临床有指导意义［7］。

本例患者就诊时取鳞屑做镜检和培养，并保存部分鳞屑备查。直接镜检阳性后立即给予口服特比萘芬和外用1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏治疗。从鳞屑中提取DNA做PCR鉴定为万博节皮菌。7 d后培养菌落分子生物学鉴定与鳞屑鉴定结果一致。取培养菌落做药敏试验证实治疗方案有效，根据每周随访培养结果共治疗5周后患者痊愈。面部难辨认癣的诊断和治疗疗程判断困难，本病例旨在将常用的实验室技术整合，用于从临床到实验室(取患者鳞屑到实验室做分子生物学鉴定和药敏试验)，实验室到临床 (分子生物学鉴定和药敏实验结果指导临床用药并监测培养确定疗程)的转化医学真菌学实践，达到个体化诊疗。

［1］金海生，许爱娥.面癣23例误诊分析［J］.中国皮肤性病学杂志，2005，19(52):123.

［2］冉玉平，代亚玲，李薇，等.疑似红斑狼疮的面部难辨认癣1例［J］.中国真菌学杂志，2006，1(3):158-160.

［3］李筱芳，陈辉，崔凡，等.浅部真菌病临床标本致病菌DNA提取方法的初步研究［J］.医学研究杂志，2006，35(3):18-20.

［4］颜丹，陈德宇，江枫，等.患皮肤癣菌病酿酒工人皮损处皮屑中DNA的提取方法［J］.中国劳动卫生职业病杂志，2007，25(8):489-490.

［5］Zhang H，Ran Y，Liu Y ，et al.Arthroderma vanbreuseghemiiinfection in three family members with kerion and tinea corporis［J］.Med Mycol，2009，47(5):539-544.

［6］萧伊伦，章强强.皮肤癣菌的形态学及分子生物学鉴定［J］.中国真菌学杂志，2008，3(5):300-308.

［7］张瑞峰，冉玉平，王鹏，等.1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏与2%酮康唑乳膏和1%特比奈芬乳膏的体外抗真菌谱及抗真菌活性对比研究［J］.中国循证医学杂志，2011，11(5):508-514.

［8］ 王端礼.医学真菌学-实验室检验指南［M］.第1版.北京:人民卫生出版社，2005:164.

［9］虞瑞尧，乐光熙.萘替芬抗真菌活性及疗效［J］.中国皮肤性病学杂志，1998，12(5):304-306.