真菌的组织病理学特殊染色

马天 宋月星 邹先彪

(解放军总医院第一附属医院皮肤科，北京 100048)

组织学检查是识别真菌的一种快速、简便的方法。炎性肉芽肿和风湿性肉芽肿的组织学评价必须包含特殊染色以确定或排除真菌和抗酸细菌的存在。在病理学日常实践和工作中，Gomori六胺银染色 (Gomori＇s methenamine silver stain，GMS)和糖原染色(Periodic acid-Schiff stain，PAS)是两种较常见的寻找组织和细胞样本中真菌的染色方法。真菌在组织切片中的存在是侵袭性感染的有力证据。在细胞学标本中，真菌可以通过它的大小和特殊的形态得到鉴定。但由于其多样性，仅仅使用一些常规的染色很难在组织切片中发现或鉴别真菌。

1 广谱真菌染色

苏木精-伊红染色 (Hematoxylin-eosin stain，HE)是一种多用途的染色方法 (见图1)。但诊断真菌病仅仅使用HE染色常常是不够的，即使在高倍镜下，也很难从组织中区分出被染色的病原菌。当HE染色切片中的真菌稀少时，很容易被忽略。有些真菌的形态特征可能不显明，有时甚至会误诊。如组织胞浆菌、皮炎芽生菌以及巴西副球孢子菌在切片中可能含有胞质，使形态鉴定变得很困难。一些真菌变种可能有不同的大小，像大形状的变种(非洲)组织胞浆菌和小形状的芽生菌。一些双相型的真菌可以在组织中形成假菌丝。有时真菌形态可以在治疗后发生改变。因此，对于无法解释的炎症过程的组织病理学检查，特殊染色是十分必要的［1-2］。用常见的特殊染色方法可以轻而易举地显示出绝大多数真菌，因此，GMS、Gridley＇s真菌(Gridley＇s fungus，GF)染色和 PAS 染色也被作为“广谱”真菌染色剂。GF染色原理与PAS染色原理基本相同，都是因真菌细胞壁由糖类构成而成阳性反应，只是以铬酸而非过碘酸氧化。GMS比较适合用来初筛，因为即使是对变性的、无法用另外两种染色法识别的真菌，它都能提供更好的对照(见图2)。

GMS和GF染色的缺点是他们掩盖了被染色真菌的天然色素，无法确定他们是无色透明的还是暗色真菌(色素)，从而无法对真菌病如暗色丝孢霉病做出确定的组织学诊断［3］。除 PAS反应，GMS和GF染色都无法显示真菌侵袭的炎症反应。为了解决这个问题，GMS同时可进行HE复染来确定真菌及宿主反应。岑玉兰等［4］对25例肺隐球菌病患者的观察中，GMS显示菌体荚膜呈黑色，其检出率为100%。GMS也可以染藻类 (原壁菌属和小球藻属)、肺囊虫的包囊 (见图3)、致病性阿米巴、大多数微孢子虫的孢壁、胞浆内颗粒、以色列放线菌和相关的菌属、诺卡氏菌、大多数结核分枝杆菌属、具有多糖荚膜的非线状菌如肺炎克雷伯菌和肺炎链球菌。而确定变性的真菌成分 (如肉芽肿内酵母组织胞浆菌)的存在需要延时硝酸银染色。

在真菌的筛选中，PAS染色与GMS同样有效。实际上它对真菌形态的显示比银染好。而PAS染色可以染色变性的真菌成分在HE染色中则可能无法显色。

干酪性肉芽肿中的钙化组织可通过PAS染色被发现，但它可能被误认为是酵母样真菌的出芽酵母、荚膜或者增厚的细胞壁。GMS和GF染色是避免误诊最好的染色方法，因为铬酸作为氧化剂可以在染色过程中溶解钙，留下未染色的钙化体。相反，GMS和 GF染色中可见的微小真菌在 PAS染色中不会出现，因此，GMS和PAS染色的联合使用可以降低假阳性率。

2 窄谱真菌染色

真菌的鉴别诊断，可能需要额外的特殊染色，使某些真菌结构染色而其他的成分不染色，这些方法被称为“窄谱”真菌染色［5-6］。如粘蛋白染色包括阿辛蓝 (alcian blue)、Mayer＇s胭脂红染色或Southgate胭脂红染色 (Southgate＇s mucicarmine stain)等可以轻易鉴别新生隐球菌黏液囊 (见图4～5)。

这种染色方法可以将隐球菌与其他形态类似的真菌区别开，如粗球孢子菌、念珠菌和组织胞浆。这些粘蛋白染色并非新生隐球菌的特异性染色，如皮炎芽生菌和西伯鼻孢子菌的细胞壁往往可被粘蛋白染剂不同程度地染色。然而，这两种真菌都无包膜，且形态各异，因此通常不会被误认为是隐球菌。在某些情况下，组织切片中无囊体的隐球菌可能不会被粘蛋白胭脂红完全染色，但新生隐球菌的细胞壁含有可能是黑色素前体的还原银的物质，它可以被黑素颗粒染剂的银染色［7-8］。这种染剂尤其对具有以下两个特征的隐球菌有效，即以无包囊侵袭性的酵母菌型存在的，也就是所谓的干性变种。这种隐球菌可能与具有相似形态的无囊体酵母菌混淆。在组织切片中，Fontana-Masson法和Lillie＇s硫酸铁染色也可以用来定位和加强组织中细胞壁含黑色素和黑色素样染色不良的皮肤暗色丝孢霉［9］。同时，PAS也可以当作窄谱染剂使用，例如，在对出芽的小酵母菌型不同的鉴别诊断中，一个弱PAS和一个强CMS染色支持组织胞浆菌的诊断，因为用PAS染色时，念珠菌、芽生菌的微缩型、马拉色菌的酵母型(见图6)的后壁会被染色。

另一种窄谱真菌染色是Ziehl-Neelson染色。一项研究表明，使用ZN染色，60%的皮炎芽生菌和47%的组织胞浆菌生物(见图7)呈酵母菌样细胞的胞质阳性染色。染色阴性主要出现在隐球菌或念珠菌，抗酸染色法很难用在内生芽孢［10］染色。

自体荧光 某些真菌或在HE染色组织切片时，萤光真菌成分在紫外线光源下［11］可见自体荧光。念珠菌属、粗球孢子菌属和曲霉菌属能表现出亮绿色到黄绿色荧光［12］。当这些真菌组织切片被PAS染色 (见图8)时可以在深橘红色背景中观察到明亮的黄色荧光［10］。自体荧光可以帮助诊断少量的或在HE染色中染色不佳部分真菌，但这一表现不稳定，不应作为最终诊断。大多数在冷冻或石蜡包埋组织切片中的真菌被Calcofluor white(一种在紫外灯下发棉白色荧光的染色剂)非特异性染色［13］。这种快速和简单的荧光染色经常用于新鲜冰冻组织的真菌检查中。免疫组化染色可用于鉴别涂片标本和福尔马林固定标本，石蜡包埋组织中的某些真菌。但是，这种技术只能局限性地应用于诊断中［14］。

3 直接免疫荧光

直接免疫荧光 (immunofluoresence，IF)可提高［15］常规病理组织诊断在真菌疾病诊断中的作用。直接免疫荧光可以用于涂片标本和福尔马林固定石蜡包埋组织切片的定性诊断，尤其是当新鲜组织无法进行真菌培养或发现非特异性图像时。亚特兰大(美国)真菌性疾病机构、疾病控制中心和其他有组织都拥有很多对常见致病真菌的诊断兼具敏感性和特异性的试剂。

免疫荧光方法有几个优点，待鉴别的真菌在HE染色和GMS染色切片后，初步鉴定可能在数小时内完成。免疫荧光可以省时省力，在处理潜在感染材料时，在荧光染色前微生物在福尔马林中被灭活，可以减少微生物的感染风险，避免污染。福尔马林固定的组织，无论是湿组织或石蜡包埋，长期储存不会影响真菌抗原性。石蜡包埋组织抗原性稳定，这可以保证在回顾性研究中或将标本远途运送至认证实验室后，其鉴定依然准确。大部分临床实验室不经常使用免疫荧光法，因为特殊的着色剂对日常病理诊断已经非常可靠了。

图1 曲霉的HE染色［16］ 图2 曲霉的GMS染色［16］ 图3 肺囊虫的GSM染色［16］ 图4 隐球菌的阿辛蓝染色［16］ 图5 隐球菌的PAS染色 (×1 000)［17］ 图6 PAS染色下的马拉色菌属［16］ 图7 ZN染色下的组织胞浆菌属［16］ 图8 PAS染色下的组织胞浆菌属(×400)［17］Fig.1 Hematoxylin and Eosin staining of Aspergillus Fig.2 GMS staining of Aspergillus Fig.3 GMS staining of Pneumocystis jirovici Fig.4 Alcian Blue staining of Cryptococcus Fig.5 PAS staining of Cryptococcus Fig.6 PAS staining of Malassezia Fig.7 ZN staining of Histoplasma Fig.8 PAS staining of Histoplasma

［1］Schwartz J.The diagnosis of deep mycoses by morphologic methods［J］.Hum Pathol，1982，13(6):519-533.

［2］Vacca LL.Laboratory Manual of Histochemistry［M］.New York:Raven，1985.

［3］Chandler FW，Kaplan W，Ajello L.Color atlas and text of the histopathology of mycotic disease［M］.Chicago:Year Book Medical，1980.

［4］岑玉兰，李勇.肺隐球菌病25例临床病理分析［J］.临床与实验病理学杂志，2010，26(2):237-238.

［5］Youngberg GA，Wallen EDB，Giorgadze TA.Narrow-spectrum histochemical staining of fungi［J］.Arch Pathol Lab Med，2003，127(11):1529-1530.

［6］Hussain Z，Martin A，Youngberg GA.Blastmyces dermatitides with large yeast forms［J］.Arch Pathol Lab Med，2001，125(5):663-664.

［7］Kwon-Chung KJ，Hill WB，Bennett E.New，special stain for histopathological diagnosis of cryptococcosis［J］.J Clin Microbiol，1981，13(2):383-387.

［8］Lazcano O，Speights VO Jr，Stickler JG，et al.Combined histochemical stains in the differential diagnosis ofCryptococcus neoformans［J］.Mod Pathol，1993，6(1):80-84.

［9］Wood C，Russel-Bell B.Characterization of pigmented fungi by melanin staining［J］.Am J Dermatopathol，1983，5(1):77-81.

［10］Jackson JA，Kaplan W，Kaufman L.Development of fluorescent-antibody reagents for demonstration ofPseudallescheria boydiiin tissue［J］.J Clin Microbiol，1983，18(3):668-673.

［11］Mann JL.Autofluorescence of fungi:an aid to detection in tissue sections［J］.Am J Clin Pathol，1983，79(5):587-590.

［12］Graham AR.Fungal autofluorescence with ultraviolet illumination［J］.Am J Clin Pathol，1983，79(2):231-234.

［13］Monheit JE，Cowan DF，Moore DG.Rapid detection of fungi in tissue using calcofluor white and fluorescence microscopy［J］.Arch Pathol Lab Med，1984，108(8):616-618.

［14］Kobayashi M，Kotani S，Fujishita M，et al.Immunohistochemical identification ofTrichosporon beigeliiin histologic sections by immunoperoxidase method［J］.Am J Clin Pathol，1988，89:(1)100-105.

［15］Reiss E，de-Repentgny L，Kuykendall J，et al.Monoclonal antibodies againstCandida tropicalismannans antigen detection by enzyme immunoassay and immunofluorescence［J］.J Clin Microbiol，1986，24(5):796-802.

［16］Abida Haque.Special stains and H＆E［M］.US:Connection，2010:187-194.

［17］王端礼.医学真菌学-实验室检验指南［M］.北京:人民卫生出版社，2005.