当归补血汤对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用研究

李志军

(河南省南阳医学高等专科学校，河南南阳473061)

当归补血汤源于金代李杲《内外伤辨惑论·暑伤胃气论》，由黄芪、当归以5∶1的比例组成，主要治疗气弱血虚、劳倦内伤、阳浮外越的发热等。近年来发现其具有促进造血、调节免疫功能、保护心脑血管等作用，从而用于治疗血液系统疾病、心脑血管系统疾病及肿瘤等。

1 材料与试剂

药物与试剂:2，4，5－三苯基四氮唑(TTC)染色剂(上海化学试剂公司产品，批号20060502)，水合氯醛(上海化学试剂公司产品，批号20090615)，多聚甲醛(上海溶剂厂产品，批号990731)，黄芪、当归等药材购于隆泰大药房，经南阳医专方家选教授鉴定均为药典品种。

动物:Wistar大鼠，SPF级，体质量200～250g，由郑州大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(豫)2007－0004。

仪器:病理图像分析系统(四川大学产品)，低速离心机(北京医用离心机厂产品)，BS124S型电子天平(美国赛多利斯公司)，超滤装置(海宁丰源科技有限公司产品)，聚砜超滤膜(海宁丰源科技有限公司产品)。

2 实验方法

处方提取液的制备:按处方比例称取药材2.0kg，回流提取2次，每次加水10倍量，每次提取1.5h，提取液浓缩至16L，3000r/min离心10min，所得上清液取10000mL备用，其余浓缩成浓度为1.0kg(生药)/L的提取液。

超滤液的制备:取处方提取液10L用0.45μm的微孔滤膜过滤，再用分子截留量为10万的超滤膜，在40℃、0.10MPa压强下超滤，超滤液浓缩成浓度为1.0kg(生药)/L的提取液。

尼龙栓子的制备:将一长50mm、直径0.24mm的尼龙线的一端加热熔成光滑的球形，并在距球端18.0mm处标记，酒精擦拭［1］。

大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的制备:用10%水合氯醛溶液(350mg/kg，ip)麻醉，参照 Longa 等［2］的方法制备大脑中动脉阻断(MCAO)模型，将尼龙线经颈外动脉(ECA)主干切口缓慢向颈内动脉(ICA)入颅方向推进，以颈总动脉(CCA)分叉处为标记，推进18～20mm，感到轻微阻力时即达到较细大脑前动脉(ACA)，阻断大脑中动脉(MCA)的所有血液供应。2h后拔出尼龙线，扎进动脉残端，缝合皮下组织和皮肤，完成缺血再灌注损伤模型。假手术组大鼠只暴露和分离出CCA，ECA和ICA，不闭塞MCA。术中严格控制室温为23～25℃。

分组及给药:Wistar大鼠64只，分为4组，每组16只。假手术组用NS等容量，模型组用NS等容量，当归补血汤提取液组用10.0g/kg，当归补血汤超滤液组用10.0g/kg，分2次灌胃，连续灌胃2周，于末次给药3天后造模，待手术结束苏醒后再给药1次，给药量10g/kg。

3 实验指标

大鼠神经功能行为学评分:再灌注24h，按Longa法［2］对动物的神经功能行为进行评分。0分为未观察到神经功能缺陷症状，1分为不能完全伸展手术对侧前爪(轻度局灶性神经功能缺陷)，2分为向手术对侧转圈(中度局灶性神经功能缺陷)，3分为向手术对侧倾倒(重度神经功能缺陷)，4分为不能自发行走，意识昏迷。

脑含水量测定［3］:动物处死后，取出大脑称湿重后将脑组织置于115℃电热干燥箱中烘至恒重，再称质量，按干湿质量法求出脑组织含水量。含水量(%)=［(湿重－干重)/湿重］×100%，脑指数=(脑湿重/体重)×100。

脑梗死范围测定［4］:再灌注24h，断头取脑，将脑置冰浴生理盐水中(2～3℃)10min，去除嗅球、小脑和低位脑干后，用生理盐水冲洗大脑使表面不留血污，吸干周围水分后，沿冠状切4刀，切成5片。然后迅速将脑片置5mL含有1%TTC的磷酸缓冲溶液中，避光温孵30min，每隔7～8min翻动1次。经染色后正常脑组织呈玫瑰红色，而梗死组织呈白色，且界限分明。温孵完毕后将脑片照相，剪下红白颜色区称重计算。然后根据重量求面积法分别计算出5个脑片共10个平面的总面积和梗死区域的面积，求出梗死区面积占半球总面积的百分比，即梗死率。梗死率=［白区质量/(白区质量+红区质量)］×100%。

采用SPASS11.5软件单因素方差分析进行统计学处理。

4 实验结果

当归补血汤对脑缺血再灌注大鼠行为学评分、脑梗死率、脑含水量和脑指数的影响见表1。

表1 当归补血汤对脑缺血再灌注大鼠各项指标的影响(±s)

表1 当归补血汤对脑缺血再灌注大鼠各项指标的影响(±s)

注:与假手术组比较，△P ＜0.05，△△P＜0.01。

脑指数假手术组 16 － 0.00±0.00 0.00±0.00 74.79±2.11 0.45±0.04组别 n 剂量g/kg 行为学评分 梗死率 脑含水量(%)模型组 16 － 7.37±0.98△△25.74±0.19△△ 79.28±0.95△ 0.52±0.12△当归补血汤提取液组 16 10.0 3.14±0.57△△11.71±0.62△△ 76.29±2.84△ 0.51±0.03△当归补血汤超滤液组 16 10.0 3.36±0.16△ 12.61±0.77△ 77.16±2.32△ 0.49±0.07△

5 讨论

中药制药过程一般包括提取、分离、浓缩、干燥和制剂等环节。其中，提取单元是中药制药现代化的关键环节之一，影响着最终药物制剂的质量和成本以及制药业的现代化水平。由于中药复方的临床疗效是多成分多靶点整体作用的结果，因此无论活性成分的含量还是它们之间的比例变化均会影响处方的疗效，但目前在中药复方纯化工艺的筛选时多选用某一种或一类化学成分来评价工艺的优劣，由于评价指标代表性差而使优选所得工艺不能保证疗效。

观察表明，提取液组和超滤液组的梗死率、行为学评分、脑含水量和脑指数没有组间差异，可见减少超滤液的服用剂量未对疗效造成显著影响，可用于当归补血汤提取液的纯化过程。

［1］Kawamura S，Shirasawa M，Fukasawa H.Attenuated neuropatho1ogy by nivadipine after midd1e cerebra1 artery occ1usion in rats［J］.Stroke，1991，22:51 － 53.

［2］Longa E Z，Weinstein P R，Car1son S，et a1.Reversib1e midd1e cerebra1 artery occ1usion wi1hout craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84 － 91.

［3］Young W，Rappaport Z H，Cha1if D J，et a1.Regiona1 brain sodium，potassium and water changes in the rat midd1e cerebra1 artery occ1usion mode1 of ischemia［J］.Stroke，1987，18(4):751－759.

［4］罗勇，董为伟.Wistar大鼠插线法局灶性脑缺血－再灌注模型的实验研究［J］.重庆医科大学学报，2002，27(1):1－4.