Aβ寡聚体预处理的BV2细胞对PC12细胞凋亡的影响

蔺慕会， 徐忠信， 陈晓虹

β淀粉样蛋白(amyloid protein，Aβ)导致的tau蛋白异常磷酸化、神经原纤维缠结、神经元凋亡被认为是导致阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要原因［1］。有研究认为小胶质细胞可在AD的发生发展中清除Aβ，起到保护神经元的作用，但也有研究认为小胶质细胞可通过炎症反应加重神经元损伤。本研究将预先被Aβ寡聚体处理的BV2细胞与PC12通过筛网共育，部分模拟体内小胶质细胞与神经元关系，来探讨小胶质细胞对神经元损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 PC12细胞购于中国科学院北京细胞生物研究所，BV2细胞购于上海复祥生物科技有限公司。细胞转移筛网购于美国BD Falcon公司;1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清购于GIBCO公司;Aβ1-42，HFIP(六氟丙醇)，抗 tau，tau(pS396)一抗、二抗购于sigma公司;BCA蛋白定量试剂盒购于美国PIERCE公司;Western blot化学发光检测试剂盒购于武汉博士德公司;MTT(噻唑蓝)购于上海华舜生物工程有限公司;双染凋亡试剂盒购于上海宝赛公司。

1.2 方法

1.2.1 Aβ 寡聚体的制备及细胞培养 按Klein WL(2002)方法制备 Aβ1 ～42 寡聚体［2］，用1640培养液(含10%胎牛血清，100u/ml青霉素，100g/L链霉素)将PC12细胞培养在24孔培养板中。用DMEM培养液(含10%胎牛血清)将BV2细胞培养在转移筛网上。在BV2细胞经Aβ1-42处理24h后，将培养液及生长有BV2细胞的转移筛网同时移入PC12细胞培养板与PC12细胞共育。

1.2.2 分组 在PC12细胞培养液中分别加入0、1、5、10μmol/L Aβ1-42 处理24h 作为对照组即Aβ+PC12;实验组则在BV2细胞培养液中加入0、1、5、10μmol/L Aβ1-42 预处理24h，然后通过转移筛网将Aβ1-42处理过的BV2细胞及培养液移入未处理过的PC12细胞培养孔共育24h，即Aβ+BV2+PC12。

1.2.3 MTT方法检测 PC12细胞抑制率 弃去 PC12 上清，加入 MTT(0.5mg/ml)，37℃孵育 4h，细胞内见到蓝色沉淀后，吸出培养上清液，每孔加入200μl DMSO，使结晶物充分溶解，空白孔调零，经全自动酶标仪于490nm处测定各孔数值(655nm作为参考波长)。细胞抑制率计算:1－(OD实验组/OD对照组)×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集细胞，PBS洗3遍，1000r/min离心10min，细胞沉淀中加入70%乙醇2ml，－20℃固定过夜，1000r/min离心10min，细胞沉淀中加入PI染色液1ml，流式细胞仪检测，用Cell Quest3.0软件分析。

1.2.5 Western blot方法检测 tau、tau(pS396)蛋白表达 将蛋白裂解缓冲液(预冷至0℃)加入经过漂洗的单层PC12细胞中，静置20min;收集细胞，用蛋白定量分析(bicinchonic acid assay BCA法)测定总蛋白浓度。加样蛋白含量50μg，经10%SDSPAGE电泳分离，4℃条件下转膜，置膜于5%脱脂奶粉封闭1h，在室温下分别加入兔抗大鼠 tau(pS396);tau一抗(1∶1000)，4℃ 过夜，室温下加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶4000)，60min。化学发光显色，计算机扫描分析。

1.2.6 统计学处理 实验数据以 χ±SD表示，采用统计程序软件SPSS10.0 for windows，采用t检验。

2 结果

2.1 MTT法检测PC12细胞抑制率 除空白对照外(0μmol/L Aβ1-42)，所有浓度的 ADDLs均可导致PC12细胞抑制，且PC12细胞抑制表现为ADDL浓度依赖性关系，即随着Aβ浓度增加PC12抑制率也明显增加，10μmol/L组最明显，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05);其中实验组PC12细胞抑制率增加更明显，10μmol/L组最明显，并且与对照组中相同浓度组比较，PC12细胞抑制率增加更明显，其差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 MTT检测PC12细胞抑制率酶标仪检测结果(OD值)

2.2 流式细胞仪分析PC12细胞凋亡率结果对照组与实验组中空白对照组均为少量PC12细胞凋亡，两组相比无统计学意义;当Aβ浓度为1、5、10μmol/L时，对照组与实验组中均可见PC12细胞凋亡增多(P＜0.05)，并呈浓度依赖性升高;Aβ浓度相同时两组比较，实验组PC12细胞凋亡进一步增多，其差异有统计学意义(P＜0.05)(见图1、图2)。

2.3 PC12细胞tau(pS396)、tau蛋白表达情况各组PC12细胞tau蛋白表达无明显差别，对照组中 Aβ(1、5、10μmol/L)组 tau(pS396)表达增多，差异有统计学意义(P ＜0.05);实验组 Aβ(1、5、10μmol/L)组中PC12细胞tau(pS396)表达明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05);实验组与对照组相同Aβ浓度组相比PC12细胞tau(pS396)表达增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

3 讨论

目前认为AD是一种由于基因缺陷直接或间接改变淀粉样蛋白前体(APP)表达或蛋白酶解过程从而影响Aβ聚集稳定性的病理综合征。Aβ导致的tau蛋白异常磷酸化，神经递质丢失，神经胶质增生和炎症反应等，最终可导致神经元功能失调，死亡。小胶质细胞作为脑内重要的免疫细胞之一，参与多种疾病的发生、发展，包括 AD［3～5］。但小胶质细胞在AD发生发展中的作用是清除Aβ保护神经元，还是通过炎症反应加重神经元损伤尚有争议。本研究通过PC12细胞抑制率、细胞凋亡检测及Tau蛋白表达变化的分析，观察了BV2细胞被Aβ寡聚体处理后对PC12细胞凋亡的影响，进而探讨了小胶质细胞在神经元损伤中的作用。

图1 Aβ(5μmol/L)对照组PC12细胞凋亡

图2 Aβ(5μmol/L)实验组PC12细胞凋亡

图3 PC12细胞tau(pS396)、tau蛋白表达

有研究发现来源于AD患者脑内的小胶质细胞对培养皿底部预先聚集的Aβ沉积物有明显趋向性，3w内Aβ沉积物被小胶质细胞覆盖。在动物实验及尸检也证实AD患者及动物模型中小胶质细胞能聚集于老年斑周围并内吞Aβ。有学者发现装载Aβ的小胶质细胞迁移到血管或脑室旁试图清除脑内Aβ。即小胶质细胞对Aβ具有趋化作用和吞噬性。关于小胶质细胞是吞噬、清除Aβ阻止AD发展，还是在Aβ作用下分泌细胞毒性物质加速AD发展，目前仍存在争议。

本研究选择与神经元有很多相似之处的PC12细胞及已被广泛用来体外培养、代替小胶质细胞的BV2细胞［6］通过细胞筛网共同培养，进而观察被Aβ寡聚体预处理的BV2细胞对PC12细胞凋亡的影响。PC12细胞来自鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系，BV2细胞来源于鼠小胶质细胞瘤细胞。筛网孔径8μm，允许筛网内外的大分子蛋白和液体交流及细胞突触通过，不允许细胞通过。该模型可分别对PC12细胞及BV2细胞的形态、蛋白质、RNA等进行检测，是较理想的模型。结果表明，所有浓度的ADDLs均可导致PC12细胞凋亡，且PC12细胞凋亡表现为ADDL浓度依赖性关系，即随着Aβ浓度增加PC12抑制率、细胞凋亡、tau(pS396)表达也明显增加，其中用Aβ寡聚体预处理BV2细胞24h后再与PC12细胞共育，与Aβ寡聚体直接处理的PC12细胞组相比，前者PC12细胞上述指标增加更明显，对照组与实验组中空白对照组未见明显的PC12细胞凋亡。提示BV2细胞能放大β淀粉样蛋白对PC12细胞的损伤，加速tau蛋白异常磷酸化，增加神经元凋亡，但“静止状态”下的小胶质细胞(Aβ寡聚体0μmol/)无神经元损伤作用。支持在病理状态下小胶质细胞在神经元损伤中起促进作用，因此可能加重AD的病情。但本研究应用的PC12细胞及BV2细胞不是原代培养的神经元及小胶质细胞，并且仅此二细胞共育，并不能完全模仿体内复杂的内环境如血液、脑脊液、其他细胞成分的影响等，因此有一定的局限性。本研究结果提示，小胶质细胞在一定条件下可促进神经元损伤。因此，进一步探讨小胶质细胞在神经元损伤中的作用机制，对于揭示AD发病机制以及为AD的临床治疗提供理论依据将具有重要的意义。

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