甲硝唑栓微生物限度检查方法学验证

王伟娜，王涛

(1.黑龙江省食品药品检验检测所，哈尔滨150001;2.哈尔滨市第五医院，150001)

甲硝唑栓用于治疗细菌性阴道炎和滴虫性阴道炎，具有抗厌氧菌和抗滴虫作用，是妇科常用药物。为有效控制药品质量，保证微生物限度检查方法的科学性和检验结果准确，笔者根据《中华人民共和国药典》2010年版[1]附录微生物限度检查的新要求，对甲硝唑栓进行了微生物限度检查方法学验证。

1 材料

1.1 培养基与试剂pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷三甲基三甲铵琼脂培养基、无菌十四烷酸异丙酯。

1.2 菌种金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、白念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]。

1.3 样品甲硝唑栓(黑龙江省富东制药有限公司，批号:101005，规格:0.5 g)。

1.4 仪器HTY-2000B型集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)，薄膜过滤器(NS01-75D2，北京牛牛基因技术有限公司)。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜斜面培养物，接种于营养肉汤培养基，在30～35℃培养18～24 h;接种白念珠菌的新鲜斜面培养物至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24 h。分别取上述培养液，用无菌0.9%氯化钠溶液10倍依次稀释至浓度为50～100 cfu·mL-1备用。取黑曲霉菌新鲜斜面培养物，加含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液[2]适量将孢子洗下，并用含0.05%聚山梨酯80的无菌0.9%氯化钠溶液10倍稀释至浓度为50～100 cfu·mL-1，备用。

2.2 供试液的制备取本品10 g，加至含无菌十四烷酸异丙酯20 mL和无菌玻璃珠的适宜容器内，置40～45℃保温，充分振摇使溶解，加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL，萃取5～10 min，静置，取水层作为1∶10的供试液。

2.3 细菌、真菌及酵母菌计数方法验证

2.3.1 试验组取1∶10供试液10 mL，置无菌条件下500 r·min-1离心3 min，取上清液1 mL加适量稀释剂，依薄膜过滤法过滤，冲洗量为800 mL，并在最后一次冲洗液中加入相应阳性细菌试验菌1 mL，取出滤膜，菌面朝上，贴于营养琼脂平板上，按规定条件培养，测定细菌数;取1∶10供试液1 mL，加适量稀释剂，依薄膜过滤法过滤，冲洗量为800 mL，并在最后一次冲洗液中加入相应的真菌及酵母菌试验菌1 mL，取出滤膜，菌面朝上，贴于玫瑰红钠琼脂平板上，按规定条件培养，测定真菌及酵母菌数(n=3)。

2.3.2 菌液组吸取上述稀释的阳性菌菌液各1 mL至平皿中，立即倾入相应的培养基，置规定条件培养，测定各阳性菌的菌落数(n=3)。

2.3.3 供试品对照组测定样品本底的菌数，方法同试验组，不加阳性对照菌(n=3)。

2.3.4 稀释剂对照组取试验用稀释剂代替供试液测定，方法同试验组(n=3)。

2.3.5 回收率结果试验组菌回收率(%)=(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。稀释剂对照组菌回收率(%)=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%。平均回收率结果见表1。

表1 细菌、真菌及酵母菌方法验证的平均回收率%

从表1可以看出，5株试验菌的试验组菌回收率与稀释剂对照组的菌回收率均＞70%，因此，可采用该法测定样品的细菌、真菌及酵母菌数。

2.4 控制菌检查方法的验证

2.4.1 试验组取2份1∶10的供试液(每份10 mL)，方法同“2.3.1”，冲洗液用量为600 mL，并在最后一次冲洗液中加入阳性对照菌铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌菌液各1 mL，取出滤膜，分别接种至胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基各100 mL中，摇匀，置30～35℃培养18～24 h;另取1∶10的供试液10 mL，加适量稀释剂，依薄膜过滤法过滤，冲洗液为800 mL，并在最后一次冲洗液中加入阳性对照菌白念珠菌菌液1 mL，取出滤膜，接种至100 mL沙氏葡萄糖液体培养基中，置23～28℃培养24～48 h。

2.4.2 阴性对照组取等量稀释剂，方法同试验组(不加阳性对照菌液)。

2.4.3 验证结果试验组检出阳性试验菌，阴性对照组无菌生长，见表2。

表2 控制菌检查方法学验证结果

从表2看出，该控制菌检查方法适用于本品的检查。

3 讨论

甲硝唑栓具有较强的抑菌作用，因此，微生物限度检查采用薄膜过滤法与低速离心-薄膜过滤法进行测定，确保样品的抑菌作用能够有效去除。按照《中华人民共和国药典》2010年版附录微生物限度检查方法要求，将离心时间由5 min更改为3 min。

甲硝唑栓为阴道用药，《中华人民共和国药典》2010年版附录微生物限度检查法规定，阴道、尿道给药制剂增加对白念珠菌的检查。控制菌检查中取消阴性对照菌的检查，以测定稀释剂作为阴性对照，应无菌生长。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:107－116.

[2]李云龙.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社，2010:400.