高效液相色谱法测定人血浆头孢米诺钠浓度

郑厚林，陈阳建

(1.浙江省宁波市医疗中心李惠利医院药剂科，315040;2.浙江医药高等专科学校，宁波315100)

头孢米诺钠的含量测定方法多有报道[1-3]，但有关其血浆浓度测定的文献报道[4]并不多见，笔者在参考相关文献的基础上，建立了一种操作简便、快速、准确，并适用于临床上头孢米诺钠血浆浓度的测定及药动学研究的反相高效液相色谱法。

1 仪器与试药

1.1 仪器日本岛津高效液相色谱仪，包括LC-10Advp型泵、SPD-10A型紫外检测器和CTO-10AS型柱温箱;N-3000色谱工作站(浙江大学智达信息工程研究所)。WX-80A旋涡仪(上海医科大学仪器厂)，TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，AB204-A电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器公司)，PHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂生产)。

1.2 试药头孢米诺钠对照品(中国药品生物制品检定所，批号:130508-200301，含量:77.4%)，阿司匹林对照品(沈阳万隆制药厂，批号:20090318，含量:99.0%)，注射用头孢米诺钠(山东鲁抗医药股份有限公司，批号:090607，规格:每瓶1.0 g)，0.9%氯化钠注射液(上海百特医疗用品有限公司，批号:S0907103，规格:250 mL∶2.25 g)，甲醇为色谱纯，冰醋酸、醋酸铵、高氯酸均为分析纯，水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 头孢米诺钠对照品贮备液的配制精密称取头孢米诺钠对照品129.2 mg置于100 mL容量瓶，加流动相溶解并定容至100 mL，得到1.0 mg·mL-1头孢米诺钠对照品贮备液，并于4℃保存。临用前用纯化水稀释至相应浓度即可。

2.1.2 内标溶液的配制精密称取阿司匹林对照品100 mg，置于100 mL容量瓶，加少量甲醇溶解，然后用流动相稀释定容至100 mL，得到1.0 mg·mL-1内标贮备液，并于4℃保存。准确移取内标贮备液2.0 mL，置于10 mL量瓶，用流动相稀释至刻度，摇匀，即为200 μg·mL-1内标溶液。

2.2 色谱条件色谱柱:Hypersil ODS2色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:20 mmol·L-1醋酸铵溶液(加冰醋酸调节pH至4.50)-甲醇-0.1%三乙胺(85∶10∶5);流速:1.0 mL·min-1;柱温:25℃;检测波长:254 nm。空白血浆、血浆样品和头孢米诺钠标准品及内标的色谱图见图1。

图1 3种溶液高效液相色谱图

由图1可知，头孢米诺钠和内标色谱峰均不受血浆中内源性杂质的干扰，且两者能够完全分离，头孢米诺钠和内标的保留时间分别为4.7和6.9 min。

2.3 血浆样品的预处理取血浆400 μL，置于1.5 mL具塞离心管，分别加内标溶液100 μL和10%高氯酸溶液250μL，涡旋振荡混匀2min，15 000 r·min-1离心8 min(离心半径:6 cm)，取上清液20 μL进样。

2.4 标准曲线与最低检测限取空白血浆400 μL，加头孢米诺钠对照品贮备液适量，分别配制成0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0，200.0 μg·mL-1血浆样品溶液，按“2.3”项操作，进行色谱分析，以头孢米诺钠/内标峰面积的比值(Y)对头孢米诺钠浓度(C)进行加权(W=1/C2)线性回归，上述各浓度对应的Y值分别为0.081，0.132，0.315，0.533，1.192，2.881，5.823，11.023，22.718 μg·mL-1，得回归方程为Y=0.021+0.113C(r=0.999 7，n=9)。结果表明，头孢米诺钠在0.5～200.0 μg·mL-1范围内线性关系良好，最低检测限0.5 μg·mL-1(S/N≥3)。

2.5 精密度实验取空白血浆400 μL，准确配制头孢米诺钠浓度为1.0，10.0，100.0 μg·mL-1的标准血浆样品各5份，按“2.3”项下操作，于同日内及连续3 d测定，所得结果代入回归方程，分别计算日内及日间精密度，结果见表1。

表1 日内及日间精密度实验结果±s

表1 日内及日间精密度实验结果±s

加入量/(μg·mL－1)日内精密度测得量/(μg·mL－1)RSD/RSD/%日间精密度测得量/(μg·mL－1)%1.00.97±0.055.160.95±0.077.37 10.09.86±0.424.269.82±0.464.69 100.099.78±1.581.59100.42±2.362.36

2.6 回收率实验

2.6.1 提取回收率实验准确配制头孢米诺钠浓度为1.0，10.0，100.0 μg·mL-1的标准血浆样品各5份，按“2.3”项操作，所得峰面积(A1)与相应浓度的头孢米诺钠对照品溶液直接进样所得峰面积(A2)进行比较。回收率(%)=A1/A2×100%，计算提取回收率，结果见表2。

2.6.2 方法回收率实验准确配制含头孢米诺钠浓度为1.0，10.0，100.0 μg·mL-1的标准血浆样品各5份，按“2.3”项操作，以头孢米诺钠测得量与实际加入量的比值计算方法回收率，结果见表2。平均提取回收率83.20%，RSD=3.35%;平均方法回收率98.51%，RSD=1.37%。

表2 头孢米诺钠回收率实验结果 %，±s，n=5

表2 头孢米诺钠回收率实验结果 %，±s，n=5

浓度/(μg·mL－1)提取回收率方法回收率1.080.1997.11 10.083.7498.63 100.085.6799.78

2.7 稳定性实验取空白血浆400 μL，准确配制头孢米诺钠浓度为1.0，10.0，100.0 μg·mL-1标准血浆样品，按“2.3”项操作，以最初的测量值为100%，每个样品重复测量3次，分别考察血浆样品在室温放置2，24 h;血浆样品于－20℃冷冻24 h后室温下解冻并反复冻融3次;以及血浆样品于－20℃冷冻30 d的长期稳定性，结果见表3。

表3 头孢米诺钠稳定性实验结果μg·mL-1，±s

表3 头孢米诺钠稳定性实验结果μg·mL-1，±s

浓度室温2 h稳定性室温24 h稳定性冻融稳定性(反复冻融3次)长期稳定性(－20℃，30 d)1.01.01±0.040.97±0.060.87±0.050.94±0.05 10.09.90±0.389.86±0.549.58±0.619.78±0.47 100.0100.88±2.31100.32±3.4694.87±4.7998.38±3.86

3 讨论

笔者在选择流动相时分别考察了20 mmol·L-1醋酸铵溶液与甲醇的比例以及流动相的pH对色谱分离效果的影响，按不同配比均发现头孢米诺钠的峰拖尾，峰形不对称，因此加入少量三乙胺。最终确定流动相为20 mmol·L-1醋酸铵溶液(加冰醋酸调节pH至4.50)-甲醇-0.1%三乙胺(85∶10∶5)，样品峰与内标峰、杂质峰均可完全分离并且无拖尾现象。

实验结果表明，10%高氯酸沉淀蛋白的效果明显好于10%和20%的三氯乙酸，沉淀完全且杂质较少，乙腈的血浆蛋白结合率相对较低且毒性较大，故选用10%高氯酸作为血浆样品处理的蛋白沉淀剂。

在内标物的选择上，曾参考相关文献[3-4]，采用对乙酰氨基酚、邻硝基苯甲酸和阿司匹林等作为内标，采用对乙酰氨基酚或邻硝基苯甲酸的分离效果并不理想，且出峰时间较长，阿司匹林作为内标物，能够得到较好的分离效果，内源性物质不干扰，且保留时间较短，缩短了分析周期，可提高样品的测定效率。

[1]吴庆欢，陈彩云，伍俊妍，等.注射用头孢米诺钠的含量测定及配伍稳定性观察[J].中国药物与临床，2007，7(7):545－546.

[2]封家福，张锦，代广会，等.反相高效液相色谱法测定注射用头孢米诺钠含量及其有关物质[J].中国药业，2006，15(10):14－15.

[3]张涛.高效液相色谱法测定注射用头孢米诺钠的含量[J].天津药学，2006，18(5):14－16.

[4]段威，夏东亚，郭涛.HPLC法测定人血浆中头孢吡肟的浓度[J].中国药房，2008，19(29):2262－2264.