以血管内皮生长因子及其受体为药靶的抗肿瘤药物的研究进展

李红，李岳，王兰，李亚，潘克俭＊

（1.成都医学院，四川 成都 610083；2.成都康弘生物科技有限公司，四川 成都 610036）

对肿瘤生长来说，建立足够的血管系统以提供氧气和营养是一个必需的过程。肿瘤血管系统的建立，依赖于体内促血管生成类因子诱导的新生毛细血管的出芽和生长［1］。Folkman［2］在1971年提出实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成（angiogenesis）这一观点，并认为抗新生血管生成疗法（anti－angiogenesis）将成为一种有效的肿瘤治疗方法［2］。虽然在随后的10余年内该观点并未受到足够重视，但后来由于碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）等发现以及新生血管染色技术的发展，用抗新生血管生成来抑制肿瘤生长和转移成为近年来研究的热点，Folkman的理论也被众多的实验所证实［3，4］。

VEGF由Ferrara等人于1989年首次从牛垂体滤泡星状细胞培养基中分离得到。VEGF可特异地结合于血管内皮细胞，促进其增生形成新生血管，且能增强血管通透性。VEGF被认为是专一、有效的刺激内皮细胞增生的因子，它还具有增加血管通透性、趋化血管内皮细胞等功能。以上这些功能的实现是依赖于VEGF与它在内皮细胞膜上的受体结合后完成［5］。近年来关于VEGF及其受体（VEGFR）与肿瘤生长、转移的关系，以及在将之作为靶分子进行的抗新生血管治疗肿瘤新药开发等方面，均取得较大的进展，目前已有数个药物经FDA批准上市。本文就VEGF及其受体在抗肿瘤血管生成治疗中的作用和研究进展作一概述。

1 以VEGF／VEGFR为靶标开发抗肿瘤药物的研究概况

VEGF及其受体在肿瘤生长和转移过程中起关键性的作用。以VEGF或其受体为靶向的治疗方式，有以下优势：1）已证实多种肿瘤细胞高表达VEGF，以VEGF为靶向，可达到广谱抗肿瘤效果并且毒副作用小；2）血管内皮细胞为二倍体细胞，遗传性稳定，耐药性小；3）药物容易到达和进入血管内皮细胞；4）容易通过非细胞毒性治疗达到目的［6］。目前已有不少以VEGF及其受体为药靶的抗肿瘤药物的研究，并且取得了不错的效果，有超过70多种候选药物已经被批准进入临床试验，其中7种药品已被美国FDA批准生产上市。现有可选择性作用于VEGF／VEGFR的药物，已进入临床试验阶段和已被批准上市的药物（表1）。这些药物均显示了一定的疗效，可以预见在不久的将来有更多的药物会进入临床试验阶段，或通过FDA审批，正式进入临床治疗。以下就对这些治疗方法做一概述。

1.1 抗体治疗

对肿瘤的抗体治疗研究已进行多年，目前有18种商业化抗体已应用于临床肿瘤治疗，例如治疗乳腺癌的人源化单抗 Herceptin（抗 HER－2）、治疗淋巴细胞瘤的Rituxan（抗CD20）和治疗急性髓细胞白血病的Mylotarg（抗CD33）等，均已通过FDA审查。由Genentech公司开发的针对VEGF－A的单抗Avastin已在2003年完成了Ⅲ期临床试验，并获得了FDA批准正式进入临床用于治疗直肠肿瘤、非小细胞肺癌、Her2阴性乳腺癌和肾癌［7，8］及复发性胶质母细胞瘤。Avastin是一人源化抗体（93%人源，7%鼠源），功能区为Fab段，可选择性识别VEGF－A的各类衍生物，但不识别VEGF的其它家族分子如VEGF－B、C等，在临床试验中未发现患者体内有抗－Avastin抗体生成，并取得较好的疗效。而针对VEGFR－2的单抗如DC101，已在动物实验中取得了初步的验证，但由于DC101选择性识别的VEGFR－2是小鼠分子Flk－1，而与人类同源分子KDR并无交叉反应，因此不能直接用于临床试验。但上述实验结果可以给人类肿瘤治疗提供一个有意义的参考，例如设计针对人类KDR分子的人源化单抗等。ImClone公司开发的抗VEGFR－2单克隆抗体，已进入Ⅲ期临床试验阶段［9］。至于选择何种靶标效果更好，是针对VEGF还是VEGFR，目前尚无定论。但有研究表明，在动物实验中，Avastin达到90%抑瘤效果的剂量只需要0.1～0.5mg／kg，而DC101却需要20～30mg／kg，其原因可能是由于仅抑制VEGFR－2并不能完全控制新生血管的生长，因为一些重要功能还通过VEGFR－1介导。

1.2 小分子蛋白激酶抑制剂

可选择性抑制VEGF及其受体酪氨酸蛋白激酶（RTK）活性的小分子合成类药物，是近年来研究的热点，许多公司都投入了大量资金进行开发。辉瑞公司开发的SU11248（Sutent），是一类小分子RTK抑制剂，目前被批准治疗肾细胞癌［10］，其机理是作用于 VEGFR－1，2，3、RET 和 CSF－1。例如血小板衍生生长因子β（PDGFβ），Flt－3和C－kit配体。Ⅲ期临床试验结果显示，该药物可延缓对诺华公司抗癌药伊马替尼（imatinib）常规治疗无效或不能耐受的胃肠道间质瘤患者的肿瘤进程6.3个月，而对照组仅为1.5个月，与对照组相比Sutent组可以减少死亡率50%［11］。由Byer／Onxy公司开发的Bay 43－9006本是一类RAF激酶抑制剂，后来发现还有较强的VEGFRs的RTK抑制活性和下调Mcl－1蛋白，能够通过阻断胞内信号传导、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管生成而发挥抗肿瘤作用。该药物商品名又为Nexavar（Sorafenib），为首个口服激酶抑制类药物，已通过FDA审查正式上市，治疗肾细胞癌［12］与肝癌［13］。SU5416是一种类醌类衍生物，为Sugen公司（后被辉瑞公司收购）开发的一种合成的VEGFR蛋白激酶抑制剂，它能结合在腺嘌呤结合袋中而使Flk－1／KDR失活。SU5416是第一个取得临床试验的抗血管小分子抑制剂，临床前试验显示了较好的抗血管生成和肿瘤抑制效果［14］；但SU5416在随后的Ⅲ期临床试验中并未显示出明确的疗效，未获得FDA批准。SU6668也是Sugen公司开发的一种小分子RTK抑制剂，但在I期临床试验中由于毒副作用过大而被中止［15］。PKT787是Novartis公司合成的另外一种小分子化合物，能强有力的抑制VEGFR1／R2受体酪氨酸激酶，在更高一些浓度时还能抑制PDGFR－β酪氨酸激酶、c－Kit和c－Fms等。目前PKT787正在进行转移性结直肠癌的Ⅲ期临床试验［16］。目前也通过FDA审批的抑制新生血管生成的小分子药物还有ZD6474，由AstraZeneca公司开发，为口服的RTK抑制剂，选择性的作用于VEGFR1／2，继而抑制新生血管从而达到抗肿瘤效应［17］。

1.3 核酸治疗

核酸治疗即利用核酶、脱氧核酶、反义核苷酸或RNA干扰来阻断VEGF或其受体分子的转录或翻译。核酶是一种RNA分子，它既有RNA特异性序列识别功能，又有位点特异性切割其他RNA分子的功能。反义核苷酸是指能够与mRNA互补配对的单链DNA或RNA片断，通常为13～25碱基对（bp），在转录和翻译水平上可阻止蛋白质的合成，加速mRNA的降解，具有抑制靶基因表达的作用。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具。通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的mRNA，封闭内源性基因表达。Pavco等［18］用针对Flk－1mRNA的核酶观察了在小鼠Lewis肺癌模型中的抗肿瘤作用，发现它能明显抑制肿瘤的生长。Zhang等［19］合成了一种能消化Flk－1mRNA底物的脱氧核酶，可在体外抑制牛主动脉内皮细胞Flk－1mRNA的表达，并抑制裸鼠体内乳腺癌细胞的新生血管生成及肿瘤生长。Bernatchez等［20］则合成了针对Flk－1的反义核苷酸，能抑制VEGF介导的内皮细胞增殖和迁移。目前已有反义核苷酸制剂如ISIS3521（特异性抑制蛋白激酶C）和ISIS5132（特异性抑制c－raf激酶）进入肿瘤治疗临床试验Ⅱ期［21，22］。以 RNAi为基础治疗AMD的Bevasiranib（美国费城Acuity制药公司）能够关闭血管内皮生长因子（VEGF）基因，能够减缓眼睛中血管的生长并改善视力，而且试验中除了药物注射位置的红肿外，没有观察到其他任何副作用。第II期临床试验结果将于今年9月揭晓。此外，Intradigm公司的ICS－283RNA干扰疗法目前正处于临床前研究阶段，期望用于结肠直肠癌的一线治疗并拓展到其他的肿瘤治疗中。

1.4 可溶性VEGFR及VEGF异构体治疗

可溶性受体是指分泌到胞外的、只含有受体胞外部分的片段，它保持有同配体结合的能力，但是由于没有胞内的激酶活性区，因此不能进行信号传导，对正常的信号传导起负调节作用。1993年Kendall等报道了一种 Flt－1的天然突变物sFlt－1（soluble Flt－1），它 只 含 有 Flt－1 胞 外 段 N 端 6 个 区 的 片段［23］。sFlt－1可以同天然的 Flt－1或 Flk－1受体形异二聚体并抑制它们介导的信号传导，因此认为这种现象是一种天然的调节VEGFR功能的机制。设计和得到可溶性VEGFR的方法有以下几种：直接用重组的方法获得可溶性的VEGFR，从VEGFR上筛选出能与VEGF相结合的肽段，或者根据噬菌体文库筛选的VEGF表位肽序列、并用人工方法进行合成，等等。也有研究者设计出基于VEGF的异二聚体，其一端的受体结合区域被突变，而另一端的仍然保留；它能同受体结合，但不能介导受体二聚化和以后的信号传导。Lu等［24］最近用重组的方法，将Flt－1单抗的可变区和KDR单抗的可变区重组成一个双特异性的二价单链抗体二聚体。它既能和Flt－1结合，又能和KDR结合，并能阻断它们同配体的结合。这种二聚体更为强有力的抑制VEGF的内皮细胞增殖功能。还有研究者在VEGF上后脸接白喉毒素或志贺氏菌毒素，称可以选择性的抑制VEGFR和肿瘤生长［25］。但上述研究都还停留在动物实验阶段，目前未见有进一步临床试验的报道。VEGF－trap是Regeneron公司开发的一种可溶性类似抗体结构的融合蛋白，是将人VEGF受体Flt－1和KDR的细胞外结构域的一部分融合到人免疫球蛋白G的Fc片断上，可特异性的捕获体内VEGF分子，阻断其与VEGFR的结合，从而抑制新生血管的形成。研究者称这种融合蛋白拥有比抗体如Avastin更高的亲和力。目前，该药物已进入临床试验 Ⅲ 期［17］。 国 内 与 VEGF－trap 结 构 类 似 的KH903亦是一种抗体融合蛋白，可高效特异地阻断VEGF与受体的结合，目前已被sFDA批准进入临床I期。

1.5 疫苗诱导主动免疫治疗

肿瘤疫苗主要分为DNA疫苗、蛋白质疫苗、肽疫苗、DC细胞疫苗以及重组腺病毒疫苗等。由于VEGF及其受体在肿瘤生长过程中的重要性，开发针对VEGF及其受体的疫苗也是肿瘤治疗研究的一个方向。Li等［26］用可溶性的Flk－1和DC细胞混合孵育，制备出DC－Flk－1细胞疫苗，体内实验显示该疫苗能抑制多种肿瘤的转移，并能激发小鼠机体产生针对VEGFR的CTL反应。另有研究者将携带Flk－1基因的真核表达载体转化减毒的伤寒杆菌，制成口服DNA疫苗免疫小鼠，可观察到针对Flk－1阳性表达细胞的CTL反应，并能抑制肿瘤在体内的生长和转移［27］。由于自身免疫反应的强度不易控制，以及实际的VEGF／VEGFR抑制效果的稳定性有待提高，因此这个领域的研究尚未进入临床试验阶段。

2 抗VEGF治疗面临的问题和挑战

VEGF治疗肿瘤耐药性问题近年越来越突出，而且缺乏有效的敏感患者筛选预测指标。对于耐药机制的研究，原因可能与肿瘤旁分泌的促炎症因子募集CD11b＋髓系细胞及自分泌因子诱导上皮细胞向间充质细胞的转变［28，29］。为此，FDA新批准雷帕霉素靶体（the mammalian target of rapam－ycin，mTOR）特异性抑制剂everolimus（Afinitor；诺华制药公司）用于 VEGFR激酶抑制剂（sorafenib，sunitinib）治疗耐药的肿瘤患者［30］。此外，安全性问题亦不容忽视，如形成血栓、出血、生殖功能障碍、伤口愈合延迟及剂量相关性3～4级的高血压［31，32］等多种毒副作用。其中，高血压的发生机制尚不确定，有3个相关学说：（1）NO学说；（2）肾脏损伤学说；

（3）先兆子痫样学说［33］。

表1 作用于VEGF及其受体的药物及其试验进展Tab.1 Drugs targeting on VEGF signal pathway

3 结论和展望

对于新生血管形成在各类病理过程中所起的作用，特别是对肿瘤生长促进的作用，目前已无较大争议，因此寻找抑制新生血管生成的分子或药物成为目前研究的热点。以VEGF家族及其相应受体作为靶分子的药物目前正在进行大规模的研究，并取得了较好的效果。值得关注的是几种已通过FDA审批的药物，如作用于 VEGF－A的单克隆抗体Avastin、作用于VEGF165的反义核苷酸类药物Macugen以及几种小分子酪氨酸激酶抑制剂如ZD6474和SU11248（Sutent），等等。比较有潜力的研究领域是利用可溶性VEGFR及其衍生的融合蛋白，通过类似抗体的机制中和VEGF，从而达到抑制VEGF活性的作用。比较有代表性的药物是VEGF－trap，目前已经进入了Ⅲ期临床试验阶段，据称该类药物相对于抗体拥有更高的选择性和亲和力。

另外，抗血管生成治疗和常规的放、化学治疗相结合的联合治疗，也是目前研究的热点之一。大多数研究者都认为，常规治疗与抗血管生成治疗的联用可达到比单一药物更好的效果，但其机理目前尚无定论。可能的解释是肿瘤内新生血管具有血管走向扭曲、内径大小不一、结构紊乱等特征，可导致灌流不足、引起瘤内缺氧，刺激VEGF的生成。而抗VEGF／VEGFR治疗可修剪多余的不成熟的新生血管，重建肿瘤内紊乱的血管生长结构，从而改善血液灌流，减少由于负反馈引起的VEGF增多并增加其它药物到达肿瘤细胞的机会。但值得注意的是联合治疗并不一定增加疗效，如 Kuenen等［34］将SU5416同顺铂、健择的联合应用时，发生了严重的血管栓塞性病变，应引起重视。因此抗血管生成治疗和常规治疗联用的方式，还需进一步的临床试验结果支持，并进行更深入的机理探讨。

在研究中还需认识到，由于VEGF／VEGFR在其他一些生理和病理过程中也发挥了重要作用，如胚胎发育、视网膜病变、风湿性关节炎、宫内膜异位症等，因此针对VEGF及其受体的抗新生血管治疗同样适用于这些疾病。例如在老年性黄斑变性的治疗研究中，抗新生血管是目前研究的热点。有多种该类型药物如Lucentis已进入临床试验阶段，反义核酸类药物Macugen已经上市。随着对VEGF及其受体研究的深入，针对该领域的研究和相关药物的开发将会进入一个快速发展的阶段。

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