MIR-122对IFN-α抗HCV效应的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和细胞含有HCV全长基因组的质粒pFL-Jc1由美国Apath公司惠赠，Huh7.5.1细胞来自美国斯克利普斯研究所Scott Forrest教授，由中国科学院上海巴斯德研究所钟劲教授提供。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、FBS和Opti-MEM 购自Gibco公司，IFN-α购自PBL公司，Trizol和 LipofectamineTM2000 购自Invitrogen公司，限制性内切酶Xba、绿豆核酸酶、蛋白酶 K、DNA marker、逆转录试剂盒和SYBR Green Taq试剂盒均购自Takara公司，T7体外转录试剂盒(T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System)购自 Promega公司，RNeasy Mini Kits购自Qiagen公司。

1.1.3 引物 U6和miR-122的逆转录引物和上下游引物均购自广州锐博公司。GAPDH上游和下游引物分别为GAAGGTGAAGGTC GAGTC和GAAGATGGTGATGGGATTTC;HCV 5＇UTR上游和下游引物分别为GCGTTAGTAT GAGTGTCGTG 和 TCGCAAGCACCCTATCAG，均由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HCV pFL-JC1的线性化取质粒44 μl，加入1 μl限制性内切酶 Xba 及5 μl相应缓冲液，37℃孵育2 h，使质粒线性化，取2 μl反应液以1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切消化完全。用酚氯仿法纯化DNA后，分别以绿豆核酸酶和蛋白酶K处理，再用酚氯仿法抽提纯化DNA，用12 μl水溶解 DNA，取1 μl跑电泳检测酶切消化后DNA片段的大小。

1.2.2 体外转录以2 μg上述线性化的DNA为模板，用promega T7 RiboMAXTMRNA体外转录试剂盒对模板体外转录，反应体系为20 μl，37℃ 孵育 2 h。RNA 产物用 RNeasy Mini Kits纯化，最后用50 μl无RNA酶水洗涤，保存于-80℃。

1.2.3 细胞培养 Huh7.5.1细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱孵育。

1.2.4 HCV细胞感染模型的建立转染前1天，以4×105个/孔密度接种12孔细胞培养板，细胞融合度为70% ～80%。转染时，取1.5 μg HCV RNA转录体，用100 μl Opti-MEM无血清培养基稀释，轻轻混匀，室温放置5 min;取2 μl LipofectamineTM2000，用1 00 μl Opti-MEM 无血清培养基稀释，轻轻混匀，室温放置5 min。将稀释的HCV RNA和LipofectamineTM2000一起轻轻混合，室温静置20 min。将200 μl复合物加入12孔板的细胞中，轻轻混匀。6 h后换液，换为完全培养基。3天后，收集上清和未处理的Huh7.5.1细胞一起孵育3h，换为普通DMEM完全培养基，培养3天后即进行后续实验。

1.2.5 IFN-α处理和miR-122 mimics转染本实验中IFN-α的作用终浓度参照文献［9］，为1 000 IU/ml，作用时间为48 h。miR-122 mimics的转染步骤同方法1.2.4，转染终浓度和时间分别为20 nmol/L、100 nmol/L和400 nmol/L和72 h。

1.2.6 HCV的逆转录和实时定量PCR 按Trizol法提取总RNA。基因组DNA去除反应包括5 ×gDNA Eraser缓冲液2 μl、gDNA Eraser 1 μl、无 RNA 酶水 3 μl和总 RNA 模板 4 μl，反应条件为42℃ 2 min。逆转录反应体系包括5× 反转录缓冲液 4 μl、反转录酶 1 μl、反转录引物混合液1 μl、无RNA 酶水4 μl和 DNA 去除反应液 10 μl，逆转录条件为 37℃ 15 min，85℃5 s。合成的cDNA作为实时定量PCR模板，反应体系包括2×SYBR Green Taq反应液10 μl、HCV或GAPDH的正反义引物各0.4 μl、Rox 0.4 μl，灭菌蒸馏水 4.8 μl和 cDNA 模板 4 μl。实时定量PCR反应条件为95℃ 30 s，共1个循环;95℃ 5 s，60℃ 34 s，共 40 个循环。IFN-α抑制率(%)=［(IFN-α处理前HCV RNA相对表达量-IFN-α处理后 HCV RNA相对表达量)/IFN-α处理前HCV RNA相对表达量］×100%，用来衡量IFN-α的抗病毒作用。

1.2.7 miRNA的逆转录和实时定量PCR 按Trizol法提取总RNA。逆转录反应体系包括5× 反转录缓冲液 2 μl、逆转录酶 0.5 μl、U6 或miR-122的特异性逆转录引物2 μl、无RNA酶水 3 μl和总 RNA 模板 2.5 μl，逆转录条件为42℃ 15 min，85℃ 5 s。合成的cDNA作为实时定量PCR模板，反应体系包括2×SYBR Green Taq反应液10 μl、miR-122或U6的正反义引物各 2 μl、Rox 0.4 μl，灭菌蒸馏水 1.6 μl 和cDNA模板4 μl，PCR反应条件同方法1.2.6。

1.2.8 统计学分析用SPSS 11.5软件进行统计学分析，每个实验重复3次，数据以±s表示。多组均数间比较采用One-Way ANOVA，两组均数之间比较采用 student-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFN-α对HCV RNA复制的影响经IFN-α 处理 0.5 h、2 h、8 h、24 h、48 h 后，Huh7.5.1细胞内的HCV RNA分别降至原来的94%、98%、79%、54%、17%(见图1)，与 IFN-α 作用呈时间依赖性，在48 h时降至最低，作为后续实验的作用时间。

图1 感染HCV的Huh7.5.1细胞经1 000 IU/ml IFN-α处理不同时间后的HCV RNA相对表达量Fig.1 The relative expression levels of HCV RNA at different time points in Huh 7.5.1 cells infected with HCV after treating with 1 000 IU/ml IFN-α

2.2 miR-122对HCV复制的影响 Huh7.5.1细胞感染HCV 72 h后，转染终浓度为20 nmol/L、100 nmol/L 和400 nmol/L 的miR-122 mimics，72 h后检测细胞内的HCV RNA相对表达量分别为12.70±3.75、15.3±1.81和24.9±6.58，均明显高于对照组(P＜0.05)。见图2。

图2 感染HCV的Huh7.5.1细胞转染不同浓度miR-122 mimics后HCV RNA相对表达量Fig.2 The relative expression levels of HCV RNA in Huh7.5.1 cells infected with HCV after transfecting different concentrations of miR-122 mimics

2.3 miR-122对IFN-α抗HCV效应的影响1 000 IU/ml IFN-α作用于转染miR-122 mimics 20 nmol/L、100 nmol/L、400 nmol/L 各组 48 h后，HCV RNA相对表达量分别为3.47±1.34、5.47±1.42、10.33±2.7，随 miR-122浓度增加而增高，并且后两组明显高于对照组(P＜0.01)，见图3。由于 IFN-α处理前，各组的HCV RNA水平不一样，我们用IFN-α抑制率来衡量IFN-α在各组的抗病毒作用。20 nmol/L组、100 nmol/L组和4 00nmol/L组的IFN-α抑制率分别为73.3% ±3.5%、64.67% ±5.5%和56.33% ±5.1%，明显低于对照组的84% ±4.5%(P＜0.05或P＜0.01)，见图4。

图3 转染不同浓度miR-122 mimics的Huh7.5.1细胞给予1 000 IU/ml IFN-α处理后细胞内的HCV RNA相对表达量Fig.3 The relative expression levels of HCV RNA in Huh7.5.1 cells transfected with different concen-trations of miR-122 mimics after treating with 1 000 IU/ml IFN-α

2.4 HCV载量对IFN-α抗病毒作用的影响由于还存在一个变量，即各组的HCV RNA表达量不同，接下来的实验来证明IFN-α抗HCV的作用是否与HCV的病毒载量有关。给Huh7.5.1 分别感染 107拷贝、106拷贝、105拷贝HCV，1 000 IU/ml IFN-α 作用 48 h 后各组的IFN-α抑制率分别为82.33% ±5%、90.33% ±7.6%和95% ±1.5%(图5)，105拷贝组 IFN-α抑制率明显高于107拷贝组(P＜0.05)。

3 讨论

由于缺乏有效的细胞模型和小动物模型，限制了对HCV生活周期和宿主-病毒之间相互作用的研究以及抗病毒药物和疫苗的研发。到目前为止，关于HCV的研究多仅限于HCV患者［10］和大猩猩［11］。随后在人肝源 Huh7 细胞株建立的HCV复制子系统使得对于HCV翻译和复制的研究成为可能［12-13］。然而，这些复制子并不能产生感染性的 HCV颗粒。Kato等［14-15］人从一名爆发性丙型肝炎患者体内分离出一株HCV全长基因克隆，以之构建的复制子能够在Huh7细胞及其他肝源性细胞和非肝源性细胞中有效的复制。接着，这个研究小组用体外转录的JFH-1 RNA转染Huh7，发现在上清分泌有感染性病毒颗粒。然而，在JFH-1 RNA转染的Huh7细胞中，病毒复制率和感染性差，并且将感染性上清孵育naïve Huh7细胞后，病毒不能复制传代。Blight等［16］人用 IFN-α长期处理含HCV复制子的Huh7细胞，消除HCV复制子，获得对HCV易感的Huh7.5细胞株。Zhong等［17］用 IFN-γ长期处理含有 I/5AGFP-6复制子的Huh7.5细胞，获得对HCV更易感的 Huh7.5.1细胞株。将 JFH-1转染Huh7.5.1细胞，能高效地分泌出感染性HCV颗粒，可重复感染Huh7.5.1细胞和黑猩猩。本研究中，我们利用高复制效能的JC-1株和易感性更高的Huh7.5.1细胞建立的HCV细胞感染模型，更加接近HCV的天然生活周期。由于临床上IFN-α为治疗HCV的主要药物，我们用IFN-α处理此细胞模型，观察其对HCV RNA复制的影响，结果显示，在IFN-α作用0.5h和2h时，HCV RNA没有明显下降，之后，在8h时才开始下降，24h已降至原来的一半，48h时降至17%，以此作为后续实验的时间点。

在本研究中，我们观察miR-122在细胞感染模型中对HCV复制的影响，结果表明，随着miR-122水平的增高，HCV RNA的相对表达量也明显升高，提示在感染模型中，miR-122促进HCV的复制，并且呈浓度依赖性。

我们观察miR-122对IFN-α抗HCV效应的影响，发现:随着miR-122水平的增高，IFN-α抑制率逐渐下降。由于除了miR-122这个变量外，还有一个变量——HCV载量，因此，我们给Huh7.5.1细胞感染不同载量的HCV后，给予IFN-α处理，观察HCV载量对IFN-α抑制率的影响。结果显示，HCV载量影响IFN-α抑制率，感染 HCV载量越多，IFN-α抑制率越低。由此推测，miR-122的表达可部分中和 IFN-α的抗HCV效应。

综上所述，本研究成功构建了HCV细胞感染模型，在此模型中miR-122促进HCV的复制。并且，进一步实验还发现，miR-122的表达可部分中和IFN-α的抗HCV效应。

［1］SKLAN E H，CHARUWORN P，PANG P S，et al.Mechanisms of HCV survival in the host［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2009，6(4):217-227.

［2］MODI A A，HOOFNAGLE J H，et al.New therapies for hepatitis C ［J］.Hepatology，2007，46:615-617.

［3］GE D，FELLAY J，THOMPSON A J，et al.Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatmentinduced viral clearance ［J］.Nature，2009，461:399-401.

［4］TANG X P，QIAN K P，YUAN X Z，et al(唐小平，钱可平，袁小珍，等).Relationship between diversity of hepatitis C virus quasispecies and viremia，actinity of liver disease and response to interferon therapy ［J］.Zhonghua Shiyan He Linchuang Bingduxue Zazhi(中华实验和临床病毒学杂志)，2002，16(2):129-132.(in Chinese)

［5］LAGOS-QUINTANA M，RAUHUT R，YALCIN A，et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse ［J］.Curr Biol，2002，12(9):735-739.

［6］CHANG J，NICOLAS E，MARKS D，et al.miR-122，a mammalian liver-specific microRNA，is processed from hcr mRNA and may downregulate the high affinity cationic amino acid transporter CAT-1 ［J］.RNA Biol，2004，1(2):106-113.

［7］ESAU C，DAVIS S，MURRAY S F，et al.miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting［J］.Cell Metab，2006，3(2):87-98.

［8］JOPLING C L，SCHUTZ S，SARNOW P，et al.Position-dependent function for a tandem microRNA miR-122-binding site located in the hepatitis C virus RNA genome ［J］.Cell Host Microbe，2008，4(1):77-85.

［9］HELBIG K J，YIP E，MCCARTNEY E M，et al.A screening method foridentifying disruptionsin interferon signaling reveals HCV NS3/4a disrupts Stat-1 phosphorylation ［J］.Antiviral Res，2008，77:169-176.

［10］TAKAKI A，WIESE M，MAERTENS G，et al.Cellular immune responses persist and humoral responses decrease two decades after recovery from a single-source outbreak of hepatitis C ［J］.Nat Med，2000，6(5):578-582.

［11］LOGVINOFF C，MAJOR M E，OLDACH D，et al.Neutralizing antibody response during acute and chronic hepatitis C virus infection ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(27):10149-10154.

［12］BLIGHT K J，KOLYKHALOV A A，RICE C M，et al.Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture ［J］.Science，2000，290(5498):1972-1974.

［13］BUKH J，PIETSCHMANN T，LOHMANN V，et al.Mutationsthatpermitefficientreplication of hepatitis C virus RNA in Huh-7 cells prevent productive replication in chimpanzees［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(22):14416-14421.

［14］KATO T，FURUSAKA A，MIYAMOTO M，et al.Sequence analysis of hepatitis C virus isolated from a fulminant hepatitis patient［J］.J Med Virol，2001，64(3):334-339.

［15］KATO T，DATE T，MIYAMOTO M，et al.Efficient replication of the genotype 2a hepatitis C virus subgenomicreplicon ［J］.Gastroenterology，2003，125(6):1808-1817.

［16］BLIGHT K J，MCKEATING J A，RICE C M，et al.Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication［J］.J Virol，2002，76(24):13001-13014.

［17］ZHONG J，GASTAMINZA P，CHENG G，et al.Robust hepatitis C virus infection in vitro［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(26):9294-9299.