螺旋藻对人外周血淋巴细胞增殖的作用

罗 夏 包志强 孙树青 杨丽敏

螺旋藻（Spirulina）富含优质蛋白质、维生素、多种矿物质、微量元素和γ－亚麻酸等不饱和脂肪酸及β－胡萝卜素等，所含人体必需氨基酸与联合国粮农组织（FAO）及世界卫生组织（WHO）所推荐的人体需要量（RDA值）极其相近［1］，所含多种生物活性物质，具有高消化吸收率，因而被FAO和世界食品协会誉为“人类最理想和21世纪最佳食品”。研究表明，螺旋藻安全、无毒，并且具有抗辐射、抗贫血、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、抗衰老等作用［2］。但其对人体免疫细胞（淋巴细胞等）的生物学效应还未见报道。本实验研究螺旋藻水提物对人外周血淋巴细胞体外增殖能力的影响。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 血液：由呼和浩特市中心血站提供健康人新鲜静脉血，即刻使用。

1.1.2 药品及试剂：实验用螺旋藻源自鄂尔多斯高原碱湖，由内蒙古加利螺旋藻业有限责任公司提供，镜检为生长良好、纯度较高的野生钝顶螺旋藻，藻粉为干净藻泥经120℃瞬时喷雾干燥后产品。刀豆蛋白A IV型（Con A IV型）为白色易溶冻干粉末，购于美国Sig ma公司。注射用植物血凝素（PHA），每支含冻干粉剂10 mg，购于美国Sig ma公司。

RPMI 1640培养基由美国Gibco公司生产；无钙镁PBS（国产试剂配制）、胎牛血清（FBS）由杭州四季青生物工程材料有限公司生产；胰蛋白酶由美国Gibco公司生产；淋巴细胞分离液购自中科院生物工程研究所；二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）购于美国Sig ma公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器：CO2培养箱（美国 For maSeientifie公司，31645／N32221－1935型）；酶标仪（美国 Bio－Rad公司，i Mar k型）；超纯水仪（德国 Millipore公司，M293986型 ）。

1.2 方法

1.2.1 螺旋藻水提物制备及Con A、PHA溶液的配制：称取螺旋藻粉，按1∶20加入I级纯化水溶解，充分缓慢搅拌均匀，将溶解液－20℃冷冻，4℃融解，反复冻融3～4次并进行超声波破碎，所得细胞悬液用低速离心机离心后取上清液。上清液用透析膜透析，透析后得到膜内和膜外液体，分别冷冻过夜，再放入冷冻干燥机中干燥，最后收集粉末，即为螺旋藻水提膜内物和膜外物。精确称取Con A及PHA粉剂，用RPMI－1640液分别配制成20μg／ml和100μg／ml溶液，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

1.2.2 淋巴细胞分组及体外培养方法：取上述静脉血50 ml用淋巴细胞分离液离心（2 000r／min，15 min），轻取白雾层，用 RPMI 1640液离心（800 r／min，6 min）2次，重悬，调整细胞密度为5×106个／ml，同时行台盼蓝染色，观察细胞存活率大于95%，将细胞悬液按每孔0.1 ml接种于96孔培养板中，每组6孔。分为正常对照组、Con A和PHA阳性对照组、螺旋藻水提物膜内和膜外组，两阳性对照组和两螺旋藻水提物组均按20μg／ml和100μg／ml不同浓度的药液加入各孔，每个浓度6孔，终体积均以RPMI 1640液补至每孔200μl。将培养板置入37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱内，继续培养72h。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖能力：培养结束前4h，每孔加入 MTT（5 g／L）20μl，继续孵育4h后，经2 000r／min，离心8 min后，轻轻吸弃上清液，每孔加入DMSO 150μl，轻轻振荡5 min，室温静置10 min，490n m波长处检测其吸光度（OD）值，并按下述公式分别计算各组淋巴细胞增殖率。

增殖率 ＝ （药物组OD－对照组OD）／对照组OD×100%

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件，首先对各组数据进行正态检验（normality Plots with Tests），方差齐时采用单因素方差分析（One－way ANOVA），方差不齐时采用非参数检验（Nonparametric Tests）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

在一定细胞密度范围内，OD值大小可以反映活细胞数量，即与增殖率呈正比。本实验结果表明，各种药物均有刺激淋巴细胞增殖的作用，其增殖率高于正常对照组（P＜0.01）。PHA和Con A作为传统的淋巴细胞激活剂均可不同程度提高淋巴细胞增殖率，并且与浓度有关，浓度高者增殖率也高；PHA促淋巴细胞增值作用强于Con A（P＜0.05），与文献报道［3］一致。螺旋藻水提物对淋巴细胞亦有提高增殖率作用，高浓度水提膜内物强于膜外物（P＜0.01）；100μg／ml水提膜内物促淋巴细胞的增殖作用比PHA更强（P＜0.05），而水提膜外物（20μg／ml）与相同浓度PHA的作用等效（P＞0.05）。由此可见，螺旋藻高剂量水提膜内物和低剂量水提膜外物提高淋巴细胞的增殖率作用强于Con A，而与PHA作用等效。见表1和图1。

表1 不同药物对正常淋巴细胞增殖作用的影响（±s，n均＝6）

表1 不同药物对正常淋巴细胞增殖作用的影响（±s，n均＝6）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.01；与Con A组比较，2）P＜0.05；与螺旋藻膜外组比较，3）P＜0.01；与PHA（100μg／ml）组比较，4）P＜0.05

组别 药物浓度（μg／ml） OD 增殖率（%）正常对照组 — 0.375±0.024—PHA 组 20 0.635±0.028 69.331）2）100 0.666±0.021 77.60 1）2）Con A 组 20 0.471±0.030 25.60 1）100 0.531±0.017 41.601）螺旋藻膜内组 20 0.586±0.022 56.27 1）100 0.695±0.012 85.33 1）3）4）螺旋藻膜外组 20 0.626±0.019 66.93 1）100 0.546±0.035 45.601）

3 讨 论

图1 不同药物作用72h的淋巴细胞增殖率

螺旋藻是蓝藻类的一个属，广泛分布于海洋或湖沼，尤其是盐碱湖等［4］；螺旋藻是近年来国内外研究与开发的热点，国内已先后研制了以螺旋藻为原料的抗辐射、抗氧化、抗肿瘤和抗衰老等药品。螺旋藻具有特殊的生物活性，能有效消除体内自由基对组织细胞的损伤，提高免疫功能，预防疾病，促进人体健康［5］。免疫细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞等，其在机体免疫调节中发挥重要作用，免疫细胞减少或功能缺失会使机体产生病变。淋巴细胞在有丝分裂原（如Con A、PHA等）刺激下，可进行新的DNA合成及细胞分化、增殖［6～8］，而增加淋巴细胞数量。与放射性同位素标记法和形态学方法比较起来，MTT比色法检测淋巴细胞增殖更加简便、准确、安全。

本实验结果显示，螺旋藻水提物能提高人淋巴细胞增殖率。与传统的淋巴细胞增殖药物相比，其作用有明显提高，其中螺旋藻水提膜内物高剂量组的增殖率最高。这种作用可能与其分子量大小及分子激活情况有关。螺旋藻水提取物经过透析膜后，膜外物中为小分子量物质，容易作用于细胞，因此低剂量即可达到较高的增殖效果（图1），而膜内物的作用，尤其高剂量组的增殖效果甚至超过了PHA，则与其分子激活、开启或关闭不同的信号通路有关，反映出不同种类细胞在相同信号刺激下，以及同种类型细胞在不同信号刺激下对刺激的应答效果或程度可存在差异［9～12］。同时提示只有重视信号传导通路的深入研究，才能探索出细胞生长抑制规律。至于螺旋藻哪种成分在人免疫系统中起主导作用有待进一步研究。

1 吴开国.螺旋藻对机体免疫调节的研究概况.广西医科大学学报，2004，21（1）：147～148.

2 涂 芳，杨 芳，郑文杰，等.螺旋藻多糖的研究进展.天然产物研究与开发，2007，17（1）：115～118.

3 刘 英，程 翔，廖玉华.地尔硫卓对刀豆凝集素诱导单个核细胞细胞因子表达的影响.中国药理学通报，2010，26（3）：376～378.

4 董 艳，刘晓婷，王淑娥，等.螺旋藻的降血糖作用.中国海洋药物杂志，2008，27（3）：46～47.

5 张志娟，乔明霞，郝言芝，等.复合螺旋藻多糖对人肝癌7402细胞的抑制作用.陕西医学杂志，2009，38（3）：279～281.

6 Lin JR，Zhou H，Lai XP，et al.Genetic identification of edible birds'nestbased on mitochondrial DNA sequences.Food ResearchInternational，2009，42（8）：1 053～1 061.

7 张 涛，赵 蕊，柳朝阳，等.川芎嗪对T淋巴细胞活化增殖的影响.中国老年学杂志，2009，29（13）：1 658～1 659.

8 陈光星，李晓娟，刘清平，等.青藤碱对T淋巴细胞活化增殖的影响.广州中医药大学学报，2008，25（5）：425～428.

9 张 雷，郑芙林，李珊珊，等.隐丹参酮对淋巴细胞增殖反应的影响.时珍国医国药，2010，21（1）：92～93.

10 Lee JB，Sriso mpor n P，Hayashi K，et al.Effects of str uctural modification of calciumspir ulan，a sulfacted poly－saccharide from－Spirulina platensis，on antiviral activity .Chem Phar m Bull，2007，49（1）：108～110.

11 Lo BNer M，Walsted A，Larsen R，et al.Enhance ment of human adaptive immune responses by ad ministration of a high－molecular－weight polysaccharide extract from the cya－nobacterium arthrospira platensis.J Med Food，2008，11（2）：313～322.

12 Majdoub H，Ben Mansour M，Chaubet F，et al.Anticoagulant activity of a sulfated polysaccharide from the green alga arthrospira platensis.Biochi m Biophys Acta，2009，1 790（10）：1 377～1 381.