手足口病危重型患儿淋巴细胞亚群及免疫球蛋白检测

莫 扬

莫 扬

湖北省襄阳市中心医院检验科，襄阳441021

本文2011－09－19收到，2011－10－25修回，2011－10－28接受

手足口病是由肠道病毒引起的急性传染病，以柯萨奇病毒A组16（Cox A16）型和肠道病毒71（EV71）型多见，多发生于学龄前儿童，尤以3岁以下发病率最高，为小儿常见的传染病，患者和隐性感染者为传染源，主要通过消化道、呼吸道和密切接触等途径传播。病毒进入人体后在肠壁细胞中增殖，增殖后可侵入血流，形成病毒血症，在易被压迫的部位如手、足血流中游离出来，再在这些部位的细胞中增殖并引起病变［1］。本文对60例手足口病危重型患儿进行外周血淋巴细胞亚群及免疫球蛋白检测，以探讨手足口病患儿免疫功能变化，为临床治疗提供实验室依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

按照卫生部医政司发布的《手足口病诊疗指南（2010年版）》［2］确诊为手足口病并符合入住ICU 指征的危重型患儿60例，其中男37例，女23例，年龄0.20～10.00岁，平均2.00岁。正常对照组30例为健康儿童，其中男17例，女13例，年龄0.50～8.00岁，平均2.50岁。

1.2 试剂和仪器

淋巴细胞亚群检测单克隆抗体CD8－FITC、CD56－FITC、CD4－APC、CD19－APC、CD3Per CP、溶血素及流式细胞仪（型号FACSCalibur）均为美国BD公司产品。免疫球蛋白Ig G、Ig A、Ig M 检测试剂由德国SIEMENS公司提供，特定蛋白仪型号为BN Prospec。

1.3 淋巴细胞亚群测定方法

采集患儿入院治疗前及健康儿童空腹静脉血2 ml，以EDTA－K2抗凝。测试分两管进行，每管取细胞数1×106／ml，采用三色直接标记，分别加入CD8－FITC／CD3Per CP／CD4－APC 、CD56－FITC／CD3Per CP／CD19－APC 各 20μl，室温暗处孵育15 min，加入溶血素溶血10 min，1 500r／min离心5 min，加PBS洗涤后上机分析，每测定管获取10 000个细胞。测定结果采用Cellquestpro软件分析：首先以FSC／SSC设门圈定淋巴细胞，然后分别以CD3－FITC／CD8－PE、CD3－FITC／CD4－APC、CD3－FITC／CD56－PE、CD3－FITC／CD19－APC的二维散点图确定CD抗原结合相应抗体的表达率。

1.4 免疫球蛋白测定方法

采集患儿入院治疗前及健康儿童空腹静脉血2 ml，3 000r／min离心10 min，分离血清，使用BN Prospec特定蛋白仪检测，方法学原理为免疫散射比浊法。

1.5 统计学处理

采用EXCEL软件进行统计分析。检测数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组淋巴细胞亚群计数

手足口病危重型患儿外周血T淋巴细胞（CD3＋CD19－）、辅助 T细胞 Th（CD3＋CD4＋）、抑制T细胞Ts（CD3＋CD8＋）数明显低于健康对照组，B淋巴细胞（CD3－CD19＋）数则较健康对照组增高，NK细胞（CD3－CD56＋）数及 Th／Ts比值无明显变化，见表1。

表1 手足口病危重型患儿组与健康对照组淋巴细胞亚群测定结果（±s）

表1 手足口病危重型患儿组与健康对照组淋巴细胞亚群测定结果（±s）

注：与健康对照组比较，1）P＜0.05

Ts健康对照组 30 67.78±6.13 35.69±5.88 26.98±5.67 16.19±4组别 n T（%） Th（%） Ts（%） B（%） NK（%） Th／13.01±7.79 1.59±0.67.96 11.25±4.71 1.51±0.54疾病组 60 50.60±13.36 1） 28.13±9.62 1） 19.03±5.72 1） 33.73±11.56 1）

2.2 两组免疫球蛋白检测结果

手足口病危重型患儿免疫球蛋白Ig G、Ig A水平明显高于健康对照组，而两组间Ig M水平无明显差异，见表2。

表2 手足口病危重型患儿组与健康对照组免疫球蛋白测定结果（±s）

表2 手足口病危重型患儿组与健康对照组免疫球蛋白测定结果（±s）

注：与健康对照组比较，1）P＜0.05

组别 n Ig G（g／L） Ig A（g／L） Ig M（g／L）健康对照组1.39±0.11 30 7.89±1.25 0.51±0.20 1.36±0.29疾病组 60 9.78±1.79 1）0.88±0.39 1）

3 讨 论

本实验结果显示手足口病患儿外周血T淋巴细胞减低。T细胞在肠道病毒感染后的免疫发病机制中起介导作用［3］，其数量减低说明细胞免疫功能下降。Th细胞在免疫应答中起辅助、诱导作用，还分泌细胞因子，启动迟发性超敏反应，诱导巨噬细胞活化。Th细胞按分泌细胞因子不同又分为Th0、Th1、Th2、Th3四种亚型，其分泌的细胞因子如白介素－2、γ－干扰素等在免疫应答中起十分重要的作用。Ts细胞毒性T细胞对清除病毒感染有重要作用，其产生依赖于Th细胞的存在。从本实验结果可见手足口病患儿细胞免疫功能下降，病毒可能直接攻击T细胞，使其迅速裂解破坏，并破坏免疫系统，引起T细胞异常分布，导致患儿T淋巴细胞、Th细胞、Ts细胞的百分率均下降。

B淋巴细胞及免疫球蛋白可反应机体体液免疫功能，有学者［4］研究发现，在细胞免疫发育尚不成熟的手足口病患儿中，若自身细胞免疫弱于体液免疫，感染EV71后有进展为重症手足口病的倾向。本文观察对象即为手足口病危重型患儿，其B淋巴细胞的百分率显著增高，免疫球蛋白Ig G、Ig A水平明显高于健康对照组，说明患儿体液免疫增强，进一步证实了上述观点。B淋巴细胞增高可能与机体增强抗病毒抗体、中和病毒作用有关。

NK细胞属于固有免疫细胞，无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒作用，并分泌多种细胞因子和趋化因子，为抗病毒免疫的第一道防线。本实验结果中NK细胞在手足口病危重型患儿中的百分率增加不明显，反映EV71病毒感染的危重期，固有免疫的作用已不能使疾病恢复，需启动不同类型的特异性免疫反应［5］，如能进一步提高NK细胞比例和增强NK细胞的活性，将有利于疾病的早期痊愈或减少心肌并发症的发生［6］。

有关手足口病患儿外周血淋巴细胞亚群和免疫球蛋白含量的报道，结果［7～9］不完全一致，这可能与病例选择分组及所用试剂、方法不同有关，有待大样本的检测结果证实。但可以确定的是手足口病危重症患儿体内存在免疫功能紊乱，提示在患儿治疗过程中可以适当给予免疫调节药物治疗。

1 牛录清，董晓君，董 伟.一起手足口病的临床及流行病学分析.中国综合临床，2000：16（3）：219.

2 中华人民共和国卫生部.手足口病诊疗指南（2010）年版.国际呼吸杂志，2010，30（24）：1 473～1 475.

3 王季午.传染病学.上海：上海科技出版社，2005：150～152.

4 Chang LY，Hsiung CA，Lu CY，et al.Status of cellular rather than humoral immunity is correlated with clinical outcome of enter ovir us 71.Pediatr Res，2006，60（4）：466～471.

5 周光炎.创新理论推动免疫学的发展：介绍和讨论一些正在流行和有创意的免疫学假说.中国免疫学杂志，2009，25（1）：27～30.

6 高玉峰，张风英.细胞因子在病毒性心肌炎病程中的研究进展.北京医学，2006，28（7）：440～442.

7 周 涛，马力忠，付四毛，等.手足口病患者体液免疫与病情转归的相关性分析.广东医学，2010，31（18）：2 434～2 435.

8 刘亚敏，王春妍，宋立文，等.手足口病患儿体液免疫检测分析.临床和实验医学杂志，2009，8（8）：73～74.

9 王跃飞，郑 瑞，陈葆国，等.手足口病相关免疫学指标检测的病例对照研究.浙江预防医学，2010，22（10）：15～16.