血管抑素基因联合32 P-胶体治疗大鼠肝癌的疗效

马 铎 于 峰 高慧棋 孟 昕 杨志杰 李 勇

(哈尔滨医科大学附属第一医院PET-CT室,黑龙江 哈尔滨 150001)

由于肝癌的发生、发展及转移的前提是肿瘤血管的形成,所以采用抗肿瘤血管生成的基因治疗可以取得良好的治疗效果。目前,在基因治疗方面国外学者们已取得共识,即尽可能的联合多种基因、多种治疗手段,以期发挥更大、更确切的抑制肿瘤生长和转移效果〔1,2〕。为此,本研究拟采用血管抑素基因联合放射性药物32P-胶体灌注于大鼠肝癌的局部,并观察其治疗效果,分析治疗机制,以期为临床上广泛应用基因治疗提供有力的理论和实践支持。

1 材料与方法

1.1 试剂及器材 总RNA提取试剂盒(Gibco-BRL公司),TUNEL荧光试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),FV500 Olympus激光共聚焦显微镜(日本),CT机为 GE公司的双排螺旋CT机。放射性32P-胶体购自北京原子高科有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血管抑素基因重组质粒的构建 用Trizol试剂盒提取总RNA。血管抑素基因上游引物为5′-CGAAGCTTGGATCCATGGACCATAAGGAAGTAA-3′,下游引物 5′-TTATGAGCACCGCTTCAGGTTGCAGTAT-3′。按照常规方法进行RT-PCR扩增,扩增后的产物连接入pMD18T克隆载体,构建血管抑素的重组质粒,测序鉴定正确后扩增并提取质粒。

1.2.2 肝癌动物模型的制备及分组治疗 雄性Wistar大鼠,体质量为140～150 g,购自吉林大学实验动物中心。将0.05 ml Walker-256肿瘤细胞(中国医学科学院药理研究所提供)接种肝叶,建立肝癌动物模型。7 d后测量肿瘤大小。大鼠分为三组:血管抑素基因治疗(治疗)组,血管抑素基因 +32P-胶体联合治疗(联合)组,空白对照(对照)组,每组均为20只。大鼠开腹暴露肝脏及其肿瘤,在肿瘤局部分3个位点注射0.2 ml药液:血管抑素基因质粒 (20 μ g)〔3〕及血管抑素基因质粒和32P-胶体混合物,对照组于瘤内注射等体积的0.9%氯化钠0.2 ml。

1.2.3 肝癌内目的基因mRNA表达 基因治疗肝癌3 d后,每组随机选取3只大鼠,分离瘤组织,提取肿瘤总 RNA,采用按cDNA序列设计合成的引物,按照常规方法进行RT-PCR扩增,扩增产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 疗效观察 ①在治疗后不同时间测量肿瘤体积(Vt),与治疗前肿瘤体积(V0)的比值为肿瘤生长率,用f表示(f=Vt/V0)。比较第7、14、21天各组间肿瘤生长率。②治疗21 d后,处死各组大鼠,取肿瘤部位组织,用10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,切片,进行光镜检查。免疫组化测定肿瘤微血管密度(MVD):先在40倍显微镜下选择癌灶内微血管最密集的5个区域,然后在200倍镜下计数每个区域中的血管数,取5个区域的平均数作为该只大鼠肿瘤的MVD值;染色为棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇、血管腔和红细胞不作为判断微血管的标准〔3〕。③细胞凋亡指数(apoptotic index,AI)的测定:采用TUNEL方法。光镜下观察,每张切片随机选取20个高倍(×400)视野,计数细胞,计算凋亡百分率,计算公式:AI=(阳性细胞数/总细胞数)×100%〔4,5〕。④肿瘤体积生长率测定:前期实验发现,开腹采用游标卡尺测量时,测量的人为误差、多次开腹测量后大鼠死亡率增加等原因对结果影响很大,并且比较开腹测量与CT测量结果,发现两者没有明显差异,所以本研究采用CT测量肿瘤大小。CT扫描条件:120 k V,140 mA,FOV 25,层厚、层距均为3 mm。测量方法:CT扫描测量肿瘤体积VT=1/6π(A×B×C)。A为肿瘤最大层面的前后径,B为肿瘤最大层面左右径,C为CT所有层面的上下径。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计学软件,数据资料以±s表示,组间比较采用 χ2检验或方差分析。

2 结 果

2.1 目的基因m RNA的表达 三者RT-PCR结果显示,在治疗组和联合组的大鼠肿瘤内,可见到大小为1 400 bp的血管抑素mRNA特异性表达条带;而对照组未见到血管抑素mRNA表达。见图1。

图1 肝癌组织内血管抑素mRNA的表达

2.2 三组治疗后肿瘤体积的比较 治疗组和联合组不同时间的肿瘤生长率均小于对照组(P＜0.01)。联合组肿瘤生长率最小。见表1。

表1 不同组别肿瘤生长率的变化(±s,n=20)

表1 不同组别肿瘤生长率的变化(±s,n=20)

与空白对照组比较:1)P＜0.01;下表同

组别 7 d 14 d 21 d空白对照组 8.49±1.35 24.65±4.57 44.42±8.79联合组 2.68±1.431) 4.89±1.97 1) 6.78 ±2.451)治疗组 5.98±1.921) 16.58±2.381) 24.75 ±4.541)

2.3 干预后各组的MVD、AI结果比较 经过治疗后,治疗组和联合组MVD均低于对照组,具有统计学差异(P＜0.01);治疗组和联合组AI均高于对照组,具有统计学差异(P＜0.01)。表明血管抑素基因主要作用于新生血管内皮细胞。联合组MVD最低,提示多种具有协同作用的因素相互作用后抑瘤效果最好。见表2。

表2 不同组别治疗后MVD和AI的变化(±s,n=20)

表2 不同组别治疗后MVD和AI的变化(±s,n=20)

组别 MVD AI空白对照组 61.54±11.36 5.46±1.54联合组 29.68±3.42 1) 24.85±3.951)治疗组 45.93±7.69 1) 15.58±3.481)

3 讨 论

肝癌是常见的恶性肿瘤,发生和发展非常复杂,其根本的原因和致病机制仍没有十分清楚,所以传统的手术、放疗、化疗等治疗手段至今对于肝癌患者,特别是中晚期患者并不能收到满意的疗效。从上世纪中期人们开始认识到肿瘤生长和转移需要肿瘤血管的支持,20世纪70～90年代已经证实肿瘤生长与肿瘤血管生长的关系密切,并提出“肿瘤血管平衡开关学说”。这些理论为血管基因治疗肿瘤方案的制订和完善打下坚实的理论基础。而许多研究〔2,6〕表明,血管抑制基因的长期应用并不引起肿瘤耐药性,所以抑制肿瘤血管的基因治疗研究受到许多学者的重视。在众多肝癌基因疗法中,抑制肿瘤血管的基因直接作用于肿瘤供血血管,能够明显抑制肿瘤血管的生长和转移,从而达到抑制肝癌生长和转移的效果。本研究的主要意义为明确血管抑素联合放射性药物32P-胶体的抑瘤效果,以便为肝癌的基因治疗奠定一个坚实的理论和技术基础。

本研究通过肿瘤体积、肿瘤MVD、肿瘤AI等指标均可证明局部给予的血管抑素可以达到抑制肿瘤生长的目的。这可能与血管抑制基因的产物通过抑制肿瘤新生血管的生长、迁移而达到治疗的作用有关〔7,8〕。除单一的血管抑素基因治疗能够产生抑制肿瘤血管生长的作用外,本研究还发现:血管抑素和放射性药物32P-胶体的联合应用可产生协同效应,即联合基因治疗的抑瘤效果明显好于血管抑素基因单一作用。32P-胶体颗粒直径1～2 μ m,发射纯 β射线,最大能量1.71 mev,平均能量0.69 mev,最大射程8 mm,组织内射程2～4 mm,14.28 d,99%能量累积在瘤内注射部位4 mm组织内。32P-胶体注入瘤内后,由于胶体颗粒大,大部分药物滞留于肝癌肿瘤组织内,肿瘤组织内受到的损伤大于周围正常组织,从而降低肿瘤的复发。本研究可初步推断:血管抑素和放射性药物32P-胶体通过抑制肿瘤血管内皮细胞增殖及迁移达到抑瘤的目的,具有很好的抗肝癌疗效。

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