槲皮素对乳腺癌MCF-7细胞电离辐射敏感性的影响

李 明，马建新，王忠明，侯吉棉，周 杰

江苏省连云港市第二人民医院放疗科，江苏连云港 222023

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%，全世界每年发患者数达130万例，每年约有50万人死于乳腺癌。近年来其发病率呈逐年上升趋势，城市中乳腺癌的发病率为女性恶性肿瘤的第二位，已经成为威胁妇女健康的严重疾病之一。随着科技的发展，在乳腺癌的治疗方面虽取得了一定的进展，但仍有较多患者出现复发和远处转移等并发症[1]。热休克蛋白（HSP）是一类保守的细胞内源性保护蛋白，可以被许多不利的情况包括高温、缺血、缺氧、重金属、代谢性毒物等多种应激所诱导，其作用就是保护细胞，参与细胞损伤的修复过程。但热休克蛋白的表达同时也保护了肿瘤细胞，使得肿瘤细胞的辐射敏感性降低，不利于放射治疗。槲皮素又名栎精、槲皮黄素，早期作为祛痰、止咳、降低血压、增强毛细血管抵抗力、降血脂等方面的药物，近年来发现其具有抗肿瘤、抗炎、消除自由基、抑制热休克蛋白表达等多种生物活性[2]。本实验主要是利用槲皮素抑制热休克蛋白的表达来研究乳腺癌MCF-7细胞辐射敏感性的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基（购自Gibco公司）；胰酶（购自Am-resco公司）；小牛血清（杭州四季青产品）；槲皮素（购自Gibco）；BSA（购自 Roche 公司）；Triton X100（购自 Amersharm 公司）；乙醇、Tris碱和氯化钠（均购自国药集团）。MTT、Giemsa染剂（美国 Sigma，华美分装）；SDS、HEPES（购自华美生物工程公司）。倒置相差显微镜 OLYMPUS CK40；THERMO FORMA3111 CO2培养箱；光学显微镜OLYMPUS CK40；酶标仪BIO-TEK；流式细胞仪 BECKMANCOULTERFC500；血细胞计数板、96孔板等。

1.2 方法

1.2.1 照射条件 采用西门子PRIMUS型医用电子直线加速器产生的6 mV高能X射线照射，照射剂量率为300 cGy/min，源皮距为100 cm，加1 cm厚度组织补偿物。

1.2.2 细胞培养与处理条件 MCF-7细胞采用RPMI 1640培养基加10%的小牛血清在37℃、5%CO2条件下培养。选对数生长期的细胞按处理方式的不同，随机分为A、B两组，A组42℃热休克处理2 h，诱导热休克蛋白表达，B组热处理前1 h加入终浓度为 50、100、150 μmol/L的槲皮素， 然后 42℃热休克处理 2 h。 4 h 后分别用 X 射线 0、2、4、6、8、10、15 Gy辐照后继续培养，用于实验。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖抑制率 选对数生长期的MCF-7细胞，消化稀释，用光学显微镜计数仪进行血细胞计数，计算细胞浓度，调整细胞浓度为1×105个/ml，然后接种96孔板，每孔 100 μl，置 37℃、5%CO2培养箱中培养 24 h。 经 A、B 组处理条件处理后，分别继续培养48 h后，弃培养基，PBS洗2次，每孔加入培养基 100 μl，MTT 10 μl（5 g/L），4 h 后除去培养基，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 μl，振荡后在酶标仪上570 nm波长处测定吸光度值D，设置6个平行样，并设空白对照。分别计算槲皮素对MCF-7细胞增殖的抑制率。增殖抑制率=[1-（DB-D空白）/（DA-D空白）]×100%。

1.2.4 细胞克隆形成实验检测细胞存活率 取对数生长期MCF-7细胞制成单细胞悬液，按照射剂量大小将不同密度的细胞接种于培养皿内，均匀分布。随着照射剂量的增大，相应增加接种的细胞数。 在照射剂量为 0、2、4、6、8、10 和 15 Gy时，密度分别为 500、500、2000、6000、10000、40000 和 80000个/5 ml。每组每个剂量点设三个平行样，待细胞贴壁后，经A、B组处理条件处理后，8 h后换为完全培养基继续培养10 d。PBS清洗两遍，甲醇固定 15 min，Gimsa 应用液（1∶9 PBS 液稀释）染色20 min，计数50个以上细胞数的克隆团。根据公式：细胞存活率SF（%）=B组克隆形成数/（接种细胞数×A组克隆形成率）×100%，求得各个时间剂量点存活分数，绘制出各时间组细胞存活曲线。

1.2.5 流式细胞术AnnexinV/PI双标法测定细胞凋亡率 取经A、B组处理条件处理后的MCF-7细胞，采用流式细胞术Annexin V/PI双标法来测定细胞凋亡。由于克隆实验表明槲皮素对X射线照射有增敏作用，且有浓度依赖关系。因此B组细胞在热处理前选用比较有代表性的150 μmol/L槲皮素处理，然后X射线照射。两组细胞再培养24 h，用0.25%胰酶消化液制成细胞悬液，用PBS离心洗2次，加入100 μl Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V （20 μg/ml）10 μl，室温避光反应 30 min，再加入 PI（50 μg/ml）5 μl，避光反应5 min后，加入 400 μl Binding Buffer，立即进行流式细胞术定量检测。

1.2.6 统计学方法 所有实验均重复3次以上，采用SPSS 10.0统计学软件对所得数据进行统计学处理，数据以均数±标准差（±s）表示，率的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测不同浓度槲皮素对乳腺癌MCF-7细胞辐射敏感性的影响

MTT法检测结果显示，用终浓度为50、100、150 μmol/L的槲皮素作用于MCF-7细胞，可以检测到在0～8 Gy剂量照射下，B 组（50、100、150 μmol/L）与 A 组不同浓度下槲皮素对MCF-7细胞增殖抑制率的比较，差异均具有统计学意义（均P<0.05），并存在浓度依赖关系。10、15 Gy剂量照射时，B组（100、150 μmol/L）与 A 组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。 见表1。

表1 不同浓度槲皮素对乳腺癌MCF-7细胞辐射敏感性的影响（±s，%）

表1 不同浓度槲皮素对乳腺癌MCF-7细胞辐射敏感性的影响（±s，%）

注：与A组比较，△P<0.05

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2.2 克隆形成实验观测不同浓度槲皮素处理后MCF-7细胞的存活率

MCF-7细胞克隆形态学观察，以50个以上的细胞组成为克隆形成的标准。经 0、50、100、150 μmol/L 不同浓度槲皮素处理后，X射线照射结果表明，不同浓度的槲皮素处理后，细胞的存活率存在差异，且在实验的浓度范围内，有一定的浓度依赖关系，浓度越大，对X射线的增敏作用越强。克隆形成实验的测定结果，见图1。

2.3 流式细胞术检测不同浓度槲皮素处理方式下MCF-7细胞的凋亡率

经流式细胞术检测，不加槲皮素处理的A组的MCF-7细胞经 0、2、4、6、8、10 Gy 射线照射后的凋亡率分别为（2.31±0.62）%、（10.84±1.37）%、（14.32±0.91）%、（21.68±0.43）%、（28.87±1.02）%和（35.13±0.98）%。处理前加入槲皮素的 B组（150 μmol/L）经X 射线照射后的凋亡率分别为（9.87±0.56）%、（17.69±1.63）%、（22.75±0.49）%、（30.16±2.23）%、（41.21±1.30）%和（48.83±1.52）%，A 组和 B 组（150 μmol/L）凋亡率比较，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。

图1 不同浓度槲皮素处理后照射MCF-7细胞存活率

3 讨论

槲皮素（Quercetin，Que）是一种黄酮类化合物，化学名为3，3′，4′，5，7-五羟基黄酮， 广泛分布于自然界各种植物的花、叶、果实之中，具有多种生物活性及药理作用，如扩张冠状动脉，降低毛细血管通透性和脆性，抗血小板聚集，抗病毒，抗过敏，镇痛，抗氧化，清除自由基，抗肿瘤等[3]。国内外大量研究证实，槲皮素对前列腺癌、白血病、鼻咽癌、肝癌、胃癌及视网膜母细胞瘤等[4-6]多种肿瘤细胞有抑制增殖的作用，是颇具应用前景的抗癌药物之一。现在研究显示槲皮素的抗癌机制主要有：①直接清除活性氧自由基、抑制脂质氧化损伤：槲皮素对超氧阴离子（O2-）、羟自由基（-OH）和单线态氧均有良好的清除作用，其量效关系明显[7]。②抑制肿瘤细胞增殖：恶性肿瘤细胞的周期调节失控，细胞分化受阻，使肿瘤细胞呈过度增殖状态，因此调节肿瘤细胞周期是槲皮素抗肿瘤作用的机制之一。槲皮素可将肿瘤细胞阻断在G0/G1、G1/S或G2/M等细胞的各个时期[3]。③诱导细胞凋亡：槲皮素能激活蛋白激酶A、蛋白激酶G，引发细胞内钙离子升高，从而诱发凋亡[8]。④对热休克蛋白和热休克因子的影响：曾文铤等[5]利用槲皮素抑制热休克诱导肝癌HepG2细胞热休克蛋白70（HSP70）的表达，发现槲皮素可以在转录水平上抑制HSP70的表达。⑤参与肿瘤相关基因的调控：槲皮素可以下调癌基因（如AKT、C-MYC）、上调抑癌基因（如P21、P300、P53）而产生抗肿瘤作用[9-10]。⑥逆转肿瘤多药耐药机制：槲皮素作为一种广泛的ATP酶抑制剂，可竞争抑制PgpNBD部分的ATP酶活性，从而抑制Pgp的药物泵功能，发挥多耐药功能[11]。

本研究主要是利用热休克作用诱导热休克蛋白表达，并用槲皮素抑制热休克表达来研究槲皮素对MCF-7细胞辐射敏感性的影响。结果显示，无论是MTT法检测细胞增殖，细胞克隆形成实验检测细胞存活率，还是流式细胞术检测细胞凋亡，都说明槲皮素可以对电离辐射起到一定的增敏作用，且在50～150 μmol/L浓度范围内有浓度依赖关系，浓度越大，增敏作用越强，可能与槲皮素抑制热休克蛋白表达有关，也可能与槲皮素直接诱导细胞凋亡有关。MTT实验发现，在照射剂量在2～10 Gy时，槲皮素可以检测到其增敏作用，但15 GyX射线照射时，槲皮素对MCF-7细胞辐射敏感性的作用与A组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。可能原因为剂量太高，掩盖了这种增敏作用。

综上所述，槲皮素对热休克蛋白高表达影响凋亡的肿瘤细胞，槲皮素可以通过抑制热休克蛋白在蛋白和转录水平的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，可见槲皮素在临床上有很大的应用价值。通过应用槲皮素，既可诱导肿瘤细胞凋亡产生治疗作用，又可打破热耐受，起到放、化疗增敏作用。因此，研究槲皮素对细胞凋亡的影响及作用机制，对于预防和治疗一些危害人类健康的重大疾病具有非常重大的理论和实际意义。

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