倪志宇,董 玫,徐之璐,文 迪,李淑瑾,丛 斌
(河北医科大学基础医学院法医学系,河北省法医学重点实验室,河北石家庄 050017)
激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)是重要的转录因子,在炎症发展过程中起着关键的转录调控作用[1]。研究发现,AP-1的过度活化并导致多种炎症介质的过量表达释放是引起内毒素休克(endotoxin shock,ES)、ARDS以及 MODS发生的重要机制[2-3]。
八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)属小分子肽类物质,参与调节中枢神经、内分泌、免疫等多系统机能活动。研究表明[4-6],CCK-8具有抗ES作用,可通过一系列信号通路抑制 TNF-α、IL-1β 等多种炎症介质的表达[7-8],从而发挥抗炎作用。但CCK-8是否通过AP-1通路调控炎症反应尚未见报道。本研究将观察CCK-8对LPS诱导RAW264.7细胞 IL-6表达及AP-1 DNA结合活性的影响,以进一步阐明CCK-8的抗炎作用机制。
1.1 材料 RAW264.7细胞(同济医科大学);大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide E.coli 0111:B4)、CCK-8(美国Sigma公司);AP-1 Consensus Oligonucleotide、NP-40、DTT、HEPES、AMV 逆转录酶(美国Promega公司);[γ-32P]ATP(北京亚辉生物公司);苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)(美国AMRESCO公司);小鼠IL-6 ELISA Kit(法国Diaclone公司);TRIzol(美国 Invitrogen公司);Taq DNA聚合酶(上海Sangon公司)。
1.2 细胞培养及分组 RAW264.7细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养,细胞生长至对数生长期时,以1×105个细胞/孔接种于24孔板(用于ELISA检测),或调整细胞浓度为每瓶1×107细胞(用于RT-PCR及EMSA检测),加入无血清RPMI 1640培养基及不同处理因素,孵育细胞。分组:①LPS诱导RAW264.7细胞不同时间IL-6的表达:细胞培养基中加入LPS(1 mg·L-1),分别孵育0、3、6、12、24 h;② 不同浓度 CCK-8 对 LPS 诱导RAW264.7细胞IL-6表达及AP-1 DNA结合活性的影响:对照组:细胞培养基中加入与实验组等体积的生理盐水;LPS组:细胞培养基中加入LPS(1 mg·L-1);LPS+CCK-8组:细胞培养基中先加入CCK-8(10-10、10-8、10-6mol·L-1),孵育 10 min 后加入LPS(1 mg·L-1);CCK-8组:细胞培养基中加入CCK-8(10-8mol·L-1)。以上各组分别孵育不同时间后检测细胞IL-6及IL-6 mRNA(24 h)的表达及AP-1 DNA结合活性(1 h)。
1.3 ELISA法检测IL-6的表达 使用ELISA试剂盒分析细胞培养上清中IL-6浓度。
1.4 RT-PCR法检测IL-6 mRNA表达 利用TR-Izol提取细胞总RNA。取4.0μg总 RNA,65℃变性5 min,经AMV逆转录酶42℃逆转录30 min,合成cDNA。取5 μl cDNA产物,依次加入10×PCR缓冲液,上、下游引物 50 pmol,dNTP 0.2 mmol·L-1,MgCl22.0 mmol·L-1,Taq DNA polymerase 1 U,以下列条件进行扩增:94℃ 3 min;94℃ 45 s;50℃ 45 s(IL-6),55℃ 45 s(β-actin);72℃ 45 s。进行 30 次循环后进一步延伸72℃ 5 min。扩增产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳。引物由上海生工公司合成。序列如下:IL-6(上游 5'-GAAATCGTGGAAATGAG-3',下游 5'-TAGGTTTGCCGAGTAGA-3',扩 增 产 物455bp),β-actin(5'-CTGTCCCTGTATGCCTCT-3',5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3',扩增产物 218 bp)。用Gel-pro凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析,用任意单位(AU)表示凝胶谱带的面积×荧光强度值,各细胞因子与β-actin的AU比值代表各mRNA相对表达水平。
1.5 EMSA法检测AP-1 DNA结合活性 含有AP-1特异性识别位点[9]的双链脱氧寡核苷酸为:5'-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3',用T4多核苷酸激酶进行末端标记[γ-32P]ATP,乙醇沉淀法纯化标记的寡核苷酸。提取细胞核蛋白。取10 μg核蛋白与同位素标记的DNA探针(3.5 pmol,3.7×105Bq)在室温下进行结合反应30 min,反应成分包括:1 mmol·L-1MgCl2,0.5 mmol·L-1EDTA,0.5 mmol·L-1DTT,50 mmol·L-1NaCl,10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.5),0.05 μg poly(dI-dC)和 4% 甘油,总体积为 10 μl。为了检测AP-1结合序列寡核苷酸的特异性,设立了阴性对照(反应体系中不加核蛋白提取物)、阳性对照、竞争性抑制结合(反应体系中加入未标记的AP-1结合序列寡核苷酸)及非竞争性抑制结合(反应体系中加入未标记的AP-2结合序列寡核苷酸)4个组。取上述DNA与核蛋白结合反应产物10 μl,加1 μl载样 buffer,混匀后经 6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳缓冲液为1×TBE,电泳条件300 V,45 min,溴酚兰移动至胶的3/4处终止电泳。将凝胶置真空干胶仪上真空干燥60℃,75 min,-80℃放射自显影48 h,显影后扫描至计算机中,用Gel-Pro凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析,取其面积与荧光强度的乘积代表AP-1的相对活性。
1.6 统计学分析 用SPSS统计分析软件进行统计学分析。数据用±s表示,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法(least significant difference,LSD)作两两比较。
2.1 LPS诱导 RAW264.7细胞IL-6的表达RAW264.7细胞培养上清中IL-6含量及细胞mRNA水平随LPS刺激时间的延长而升高,于LPS刺激后24 h达到高峰,与其他时间点相比差异均有显著性(P <0.01,P <0.05)。见 Tab 1,Fig 1。
Fig 1 Expression of LPS-induced IL-6 mRNA in RAW264.7 cells for different time
Tab 1 Production of IL-6 in RAW264.7 cells induced by LPS for different time(±s,n=3)
Tab 1 Production of IL-6 in RAW264.7 cells induced by LPS for different time(±s,n=3)
△△P<0.01 vs LPS 0 h group;**P<0.01 vs LPS 24 h group
Group IL-6/ng·L-1 IL-6 mRNA(IL-6/β-actin ratio)LPS 0 h 0.00 ±0.00 0.097 ±0.031 LPS 3 h 99.90 ±20.47△△** 0.489 ±0.182△△**LPS 6 h 223.98 ±19.79△△** 0.764 ±0.046△△**LPS 12 h 1109.23 ±16.37△△** 0.902 ±0.027△△**LPS 24 h 2071.64 ±9.08△△ 1.157 ±0.045△△
2.2 不同浓度CCK-8对LPS诱导RAW264.7细胞IL-6表达的影响 1 mg·L-1LPS孵育RAW264.7细胞24 h,细胞上清中IL-6含量及细胞IL-6 mRNA水平明显高于对照组(P<0.01)。10-10mol·L-1CCK-8对LPS诱导的IL-6生成无明显影响,10-8、10-6mol·L-1CCK-8 可明显抑制 LPS 诱导的 IL-6生成,和 LPS组相比抑制率分别为38.5%、67.9%(IL-6含量)及43.6%、65.6%(IL-6 mRNA)(P <0.01)。见 Tab 2,Fig 2。
Fig 2 Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-6 mRNA expression in RAW264.7 cells
Tab 2Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-1β production and AP-1 DNA-binding activity(±s,n=3)
Tab 2Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-1β production and AP-1 DNA-binding activity(±s,n=3)
**P<0.01 vs control;▲▲P<0.01 vs LPS
Group IL-6/ng·L -1 IL-6 mRNA(IL-6/β-actin ratio)AP-1 DNA-binding activity(Darea·Ddensity Control 10.62 ±4.54 0.093 ±0.015 113.27 ±4.10 LPS 2071.64 ±9.08** 1.157 ±0.031** 593.87 ±11.77**LPS+CCK-8 10-10mol·L-1 2064.08 ±11.42** 1.127 ±0.032** 584.63 ±10.08**LPS+CCK-8 10-8mol·L-1 1274.19 ±13.87**▲▲ 0.653 ±0.031**▲▲ 333.17 ±5.56**▲▲LPS+CCK-8 10-6mol·L-1 665.85 ±13.87**▲▲ 0.398 ±0.013**▲▲ 194.87 ±5.97**▲▲CCK-8 10 -8mol·L -1)16.67 ±6.93 0.083 ±0.015 101.00 ±5.41
2.3 不同剂量CCK-8对LPS诱导RAW264.7细胞AP-1 DNA结合活性的影响 对照组RAW264.7细胞核内检测到少量与特异性寡核苷酸探针结合的AP-1。1 mg·L-1LPS孵育 RAW264.7细胞1 h,细胞内AP-1活性明显高于对照组(P<0.01)。10-10mol·L-1CCK-8对LPS诱导的AP-1活性无明显影响(P >0.05)。10-8、10-6mol·L-1CCK-8 浓度依赖性地抑制了LPS诱导的 AP-1活性,抑制率为43.9%和67.2%(P <0.01)。10-8mol·L-1CCK-8单独孵育对RAW264.7细胞AP-1活性无明显影响。用同源性寡核苷酸(含AP-1结合位点)及异源性寡核苷酸(含AP-2结合位点)作为竞争物证实了DNA-蛋白结合的特异性(Tab 2,Fig 3)。
Fig 3 Effects of CCK-8 on AP-1 DNA-binding activity in LPS-induced RAW264.7 cells
巨噬细胞系统是体内启动炎症介质产生的中心细胞,是调控炎症反应的主要细胞。在参与炎症反应的众多介质中,最有影响的是 TNF-α、IL-1β、IL-6等,与内毒素休克发病和死亡的关系也最为密切[8,10]。本研究发现,LPS 刺激可迅速诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞IL-6及其mRNA的表达,而预先给予CCK-8可明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞 IL-6及其 mRNA的表达。说明CCK-8通过抑制促炎性细胞因子的表达参与机体抗炎反应过程,且CCK-8对细胞因子生成的调控作用发生在转录水平。这与本室报道CCK-8可抑制LPS诱导的大鼠 PIMs TNF-α[7]、IL-1β[8]表达的结果一致。我们前期的研究显示,LPS刺激后,可迅速诱导RAW264.7细胞 IL-1β的表达,并于 3h达到高峰[8]。与IL-6相比,IL-1β表达峰值的时间早,但增长幅度小,持续时间短;而IL-6表达峰值的时间晚,但增长幅度大,持续时间长。提示了IL-6在促炎反应中起着非常重要的作用。
在细胞内复杂的信号级联反应中,转录因子是将信号传递至靶基因的最后环节,在信号转导过程中起着十分重要的作用。已知在LPS诱导的炎症反应中,LPS与其受体CD14、TLR4结合,将LPS信号由细胞外传导至细胞内,通过一系列信号通路使NF-κB、AP-1等转录因子激活,诱导炎症介质的表达[11]。大量研究表明抑制AP-1活性可减轻炎症反应[12-13]。而且直接抑制转录因子活性而不是单纯抑制某一种炎症蛋白的表达,抗炎效果更为明显。一些抗炎药物包括糖皮质激素、阿司匹林及圈套寡核苷酸技术均从不同水平抑制或阻断AP-1活性以抑制炎症反应。本研究发现,LPS孵育RAW264.7细胞1 h,可使细胞内AP-1活性明显增高,CCK-8预孵育则浓度依赖性抑制了LPS诱导的AP-1活性,表明CCK-8对LPS诱导的AP-1活性增高具有抑制性调节作用。
有研究表明在IL-6基因非表达调控基序中含有AP-1的结合位点,说明AP-1在IL-6基因表达中起重要作用[9]。综合前期的研究成果,我们认为,CCK-8 可通过抑制信号通路中 CD14[14]、TLR4[15]、PKC[6]、p38 MAPK[8]、NF-κB[7]、AP-1 等多层次、多靶点调控TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性介质的表达,从而发挥抗炎作用。提示我们在一些急慢性炎症相关性疾病的治疗中,CCK-8可能是一种潜在有效的治疗因子。
本实验中,对LPS诱导的RAW264.7 IL-6的表达有抑制作用的CCK-8的剂量为10-8~10-6mol·L-1,属于超生理剂量,但对静息状态下的RAW264.7细胞却无明显影响。我们前期研究发现[16],肺巨噬细胞有CCK受体表达,LPS可诱导其表达上调,且内毒素血症时肺组织CCK-8受体mRNA表达上升与减轻肺组织形态损伤有关。说明内毒素在对机体损伤的同时也启动了机体的保护机制,CCK受体表达增加可能是保护机制之一。因此LPS激活的RAW264.7细胞能够对大剂量CCK-8产生反应,而静息状态下的RAW264.7却无应答。
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