乙肝病毒x蛋白结合蛋白抑制阿霉素诱导HepG2细胞凋亡的机制研究

王凤泽，费洪荣，张显忠，高丽君

(泰山医学院1.生物科学学院、2.医药生物技术研究所、3.药学院，山东 泰安 271016)

原发性肝细胞癌为我国常见的高发性恶性肿瘤，系统化疗是临床常用的治疗方法之一。虽然一些新型药物的应用使肝癌的化疗呈现出新局面，但肿瘤耐药性的存在使得化疗对肝细胞癌的有效性大为降低［1］。乙肝病毒 x蛋白结合蛋白(Hepatitis B x-interacting protein，HBXIP)由于能够与乙肝病毒x蛋白(HBx)的C末端结合而被命名，其在肿瘤组织中高表达，可分别与HBx、survivin和hSuv3p蛋白结合而参与调控 HBv复制、细胞凋亡、有丝分裂及RNA代谢等生命过程［2－5］。我们前期实验结果表明，HBXIP可以通过活化Akt而促进肝癌细胞的增殖［6］;通过调节 cyclinD1、p21 和 p27 等蛋白表达而参与细胞周期的调控［7］。本实验旨在研究HBXIP对阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX，adriamycin，ADM)诱导肝癌细胞凋亡的抑制作用，并探讨其可能的分子机制，为提高化疗药物的疗效提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;稳定高表达HBXIP基因的 HepG2细胞系由本室保存［6］。RPM 1640培养基和胎牛血清购于Gibco;DOX购自Sigma;G418和DAPI购自Merck;ECL显色试剂盒购自Pierce;Bcl-2抗体购自Santa Cruz;caspase-3，-9和PARP抗体购自Cell Signaling;β-actin抗体购自Sigma;Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HepG2细胞用RPMI 1640培养基，含有10%胎牛血清，100 U·L－1青霉素和100 μg·L－1硫酸链霉素，37℃和5%CO2条件下孵箱培养。

1.2.2 MTT分析 接种约4×104个细胞于96孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。分别加入适当浓度的DOX于各孔中继续培养24 h。终止培养前4 h加20 μl(5g·L－1)的 MTT 于各个孔中，然后吸去孔中的培养液，再加入150 μl的DMSO，用酶标仪(波长490 nm)测定各孔的A值，设定6个平行孔，对结果进行统计分析。细胞生长抑制率/%=(1－药物组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3 DAPI荧光染色 取对数生长期的HepG2细胞，接种于24孔板中，次日待细胞贴壁后给予DOX处理24 h，然后DAPI染色20 min，荧光显微镜观察结果。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞用DOX处理后，胰酶消化并制备细胞悬液，按照试剂盒说明进行AnnexinV-FITC/PI法测定细胞凋亡，根据AnnexinV和PI的荧光强度计算凋亡百分率。实验重复3次。

1.2.5 免疫印迹分析 预冷PBS洗细胞后加入细胞裂解液(10 mmol·L－1Tris-HCl pH 8.0，1 mmol·L－1EDTA，150 mmol·L－1NaCl，1%NP-40，1 mmol·L－1PMSF，1%SDS，protease inhibitor cocktails)，冰上放置20 min后4℃ 13 000×g离心20 min，收集上清定量分析。取40 μg总蛋白进行SDS-PAGE实验，电转移至PVDF膜上，5% 脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗，室温孵育3 h后加入二抗室温孵育1.5 h，PBST洗膜，ECL显色试剂盒于暗室曝光显影。实验重复3次。

1.2.6 统计学分析 各组实验均独立重复3次。实验数据以±s表示，采用t检验。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞的存活率 采用MTT法分别检测经一定浓度DOX处理的HepG2-hbxip细胞和对照组的生存率。结果表明，HBXIP的高表达可拮抗DOX对HepG2细胞活力的抑制作用(Fig 1)，0.5、1.0和 2.0 mg·L－1DOX 处理组中 HepG2-hbxip细胞存活率明显高于对照组细胞(P＜0.05)，4.0 mg·L－1DOX处理组则无统计学意义。

2.2 HBXIP抑制DOX诱导的HepG2细胞凋亡荧光显微镜下观察发现，pCMV-tag2B组细胞经DOX处理24h后，部分细胞的细胞核明显皱缩变小，荧光着色较深(Fig 2A)。而HepG2-hbxip组细胞则大部分保持正常形态，荧光均匀。Annexin VFITC/PI凋亡检测结果表明，经1.0 mg·L－1DOX处理24 h后，HepG2-hbxip组细胞处于凋亡状态的比率明显少于对照组(pCMV-tag 2B)细胞(Fig 2B)。

Fig 1 Cell viability measured by MTT assay

Fig 2 Overexpression of HBXIP in HepG2 cells inhibited apoptosis induced by DOX

2.3 HBXIP对DOX所致胱天蛋白酶家族相关蛋白活化的影响 胱天蛋白酶家族的级联活化与细胞凋亡密切相关，而caspase-3和 caspase-9是该家族中的两个重要成员。由于DOX促进肿瘤细胞的凋亡与活化胱天蛋白酶家族成员关系密切［8］，因此本实验检测了HBXIP对DOX活化caspase-3和caspase-9的影响。免疫印迹实验结果表明，DOX作用HepG2细胞后，促使细胞内pro-caspase-9和procaspase-3剪切成活性形式，将PARP切割成85 ku的产物，并下调细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达;而HBXIP的高表达则能够部分减少DOX所致caspase-3和 caspase-9的活化，同时抑制PARP的剪切，并拮抗DOX对Bcl-2表达的抑制作用(Fig 3)。

Fig 3 Detection of the expression of apoptotic-related

3 讨论

HBXIP基因由 Melegari等于1998年首次从HepG2细胞中克隆获得。作为HBx的结合蛋白，HBXIP能特异地结合HBx的C末端，并降低HBx的活性，从而改变乙型肝炎病毒的复制周期;作为survivin的协同因子，HBXIP与 survivin的复合物可以与pro-caspase-9结合，使survivin通过细胞色素C介导的凋亡途径选择性地抑制胱天蛋白酶活性，进而实现对细胞凋亡的抑制。我们前期的研究结果显示，HBXIP具有促进细胞增殖的作用，且在肝癌组织中高表达，因此推测HBXIP在肝癌的发生发展中具有重要作用。

化疗是肝细胞癌综合治疗的重要手段之一，但多数患者随着化疗疗程的延长会出现继发性耐药，这使得化疗的有效率不超过30%。DOX作为癌症化疗的一线药物，其主要作用是通过诱导肿瘤细胞的凋亡而发挥抗肿瘤作用。但包括肝癌在内的多种癌症时常对DOX产生耐药性，其机制可能与抑制DOX诱导的细胞凋亡密切相关［9－10］。本研究以肝癌细胞系HepG2为实验材料，在建立稳定高表达HBXIP蛋白细胞系的基础上，系统地研究了HBXIP对DOX诱导HepG2细胞凋亡的抑制作用及可能的分子机制。实验结果表明，HBXIP对DOX诱导的HepG2细胞凋亡具有抑制作用，其机制可能与HBXIP抑制了胱天蛋白酶家族成员活化有关，目前国内外未见相关文献报道。

Caspase是一类半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中发挥着重要作用［11］。细胞经凋亡诱导后，释放到细胞液中的细胞色素C(cyto-C)与凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)聚合成多聚复合物，并促使procaspase-9与该复合物结合形成凋亡小体而激活procaspase-9，活化的 caspase-9又可激活 caspase-3，发生诱导细胞凋亡的级联反应［12］。本研究采用免疫印迹实验检测了DOX对HepG2细胞内caspase-3和-9表达的影响，结果表明一定浓度的DOX诱导细胞凋亡活性与胱天蛋白酶家族成员中caspase-3和-9的活化密切相关;而在HBXIP高表达的HepG2细胞中，DOX诱导pro-caspase-3和-9活性剪接则受到抑制，其机制是否与HBXIP抑制Apaf-1向caspase-9聚集则有待于进一步研究。

综上所述，HBXIP具有拮抗化疗药物DOX诱导肝癌细胞凋亡的作用，其分子机制可能与HBXIP拮抗DOX活化HepG2细胞中凋亡相关蛋白caspase-3，-9等因子有关。阐明HBXIP在肝细胞癌发生中的作用机制及其与DOX耐药的相关性可为肝癌的临床治疗提供新思路。

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